云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产

第 23 卷第 4 期 2001 年 12 月湖北大学学报 (自然科学版)Vol . 23 No . 4Journal of Hubei University(Natural Science Edition) Dec . ,2001 文章编号 :1000 - 2375 (2001) 04 - 0366 - 04云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产陈永勤1 ,朱蔚华2 ,吴蕴祺2 ,胡秋2(1. 湖北大学生命科学学院 ,湖北 武汉 430062 ;中国医学科学院 ,中国协和医科大学 药物研究所 ,北京 100050)摘 要 :研究了在固体和液体培养条件下云南红豆杉 ( Taxus y unnanensis ) 细胞系 TY6 生长和紫杉醇积累的动态及培养基中无机氮源形式对其生长的紫杉醇形成的影响. 结果表明 ,在固体和液体培养条件下 ,云南红 豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态相似 ,但液体培养时细胞生长周期缩短了 7 d ,紫杉醇含量降低了 1 倍 ; 新形成的细胞需要经过一段时间生长后才有较高的紫杉醇合成能力 ; 培养基中硝态氮浓度高有利于细胞生长 ,铵态氮浓度高有利于紫杉醇形成 ;在培养第 12 d 时用铵态氮培养基更换硝态氮培养基可使悬浮细胞的紫杉 醇产量达到 8. 5 mgL - 1 ,比对照高 1. 6 倍 .关键词 :云南红豆杉 ;细胞培养 ;紫杉醇 ;无机氮中图分类号 :Q813. 1文献标识码 :A从红豆杉属植物中分离出来的紫杉醇 ( Taxol) 已成为临床上治疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物1. 由于受红豆杉属植物资源的限制 ,人们一直试图利用化学合成方法和植物细胞工程技术来解决紫杉醇药源短缺的问题 ,但均未达到商业应用水平 . 在红豆杉属植物细胞工程研究方面 ,人们已对多种红豆杉进 行了细胞培养 ,并在细胞培养技术和提高紫杉醇含量等方面取得了一些进展1 . Fett - Neto 等2 和 Srini2vasan 等3 还分别研究了培养周期中东北红豆杉细胞和欧洲红豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态. 罗建 平等4 曾报道了云南红豆杉愈伤组织的生长动态 ,但没有报道紫杉醇含量的变化. 我们在进行云南红豆 杉组织培养时 ,选到了一个紫杉醇含量较高的细胞系 ( TY6) ,并研究了它在固体培养和液体培养时的生 长和紫杉醇积累动态及培养基中无机氮源形式对其生长和紫杉醇生产的影响.1 材料与方法1. 1细胞系的建立云南红豆杉 ( Tax us y unnanensis Cheng et L . K. Fu) 愈伤组织的诱导和继代培养方 法同前5 .悬浮细胞培养是通过将愈伤组织接种在液体增殖培养基中 、在摇床上震荡培养建立起来的 ,第一代 为 7 d ,第二代和第三代为 10 d ,以后每 15 d 继代 1 次 .培养基和培养条件同前6 .1. 2愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇积累动态将继代 20 d 的愈伤组织接种在增殖培养基上 ,每隔5 d 随机取 6 瓶 ,记录鲜重 ;烘干后再称其干重 ,并分析紫杉醇含量.悬浮细胞培养时 ,为了使各瓶的细胞均匀一致 ,先让各瓶细胞培养物静置片刻 ,倒出上层培养液 ,再 将剩下的细胞培养物倒入装有新鲜增殖培养基的 2 000 mL 三角瓶中. 摇匀后 ,分装到 250 mL 三角瓶中 ,每瓶 80 mL ,接种量为 7 . 09 0 . 15 gL - 1 干细胞. 接种后每 3 d 取样一次 ,每次随机取 3 瓶 . 细胞离心收 集 ,烘干后用于细胞干重和紫杉醇含量的测定. 无细胞的培养液用于紫杉醇和糖浓度测定.1 . 3NO - 和 NH+对愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇含量的影响在愈伤组织试验中 ,设 4 种 NO -343和 NH + 浓度不同的处理组合 (表 2) . 用 KNO 和 HN Cl 调节各处理的 NO -和 NH + 浓度 ,用 KCl 平衡其43434收稿日期 :2000 - 11 - 24基金项目 :湖北省教育厅科研基金 (98B004)作者简介 :陈永勤 (1961 - ) ,男 ,博士 ,副教授K+ 浓度. NH Cl 为过滤灭菌 ,其它成分为高温灭菌. 培养 30 d.4悬浮细胞培养方法同 1 . 2 ,但培养容器为 500 mL 三角瓶 ,每瓶 130 mL . 培养至第 12 d 时 ,将 3 瓶的培养基倒尽 ,倒入无机氮全为 NH + 的新鲜增殖培养基 ,每瓶培养物最终体积与对照大致相同 . 试验至第419 d 结束. 细胞离心收集 ,烘干后用于测定干重和紫杉醇含量.1. 4生长分析 、糖浓度和紫杉醇含量测定固体培养时 ,难以使各瓶的接种量一致 ,所以采用增长指数 作为考察愈伤组织的生长指标. 增长指数 = (收获鲜重或干重 - 接种鲜重或干重) 接种鲜重或干重.培养基中糖的浓度用硫酸 苯酚法测定7 .细胞中紫杉醇含量的测定按 Wu 等8 建立的高效液相色谱法进行. 无细胞培养液用等量的二氯甲 烷萃取 2 次 ,二氯甲烷部分减压蒸干后用甲醇定容 ,其后处理同细胞样品. 高效液相色谱条件为 : Shi2 madzu LC - 6A 高效液相色谱仪 , Shimadzu SPD - 6A 紫外检测器 , Rheodyne 7125 进样阀和 Shimadzu C - R3A 积分仪. 色谱柱为 Plantinum C18 柱 (250 mm 4 . 6 mm ,5m ,Alltech ,USA) ,流动相为甲醇 乙腈 水(25 :35 :45) ,流速为 1 . 0 mLmin - 1 ,检测波长为 227 nm. 样品中紫杉醇含量通过外标法计算得出.细胞中产生的紫杉醇经 HPLCMS 确证.2 结果与分析2. 1 云南红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇积累动态 在固体培养基上 ,云南红豆杉细胞的生长周期为25 d ,无明显的延迟期 ,其鲜重和干重在接种后几乎以相等的速率快速增加 ,并分别在 20 d 和 25 d 达到 最大值 ,然后开始下降 ( 图 1) . 在整个培养周期中 ,干重和鲜重最多可增加 1 . 5 倍左右 ,增倍时间约为 15 d.愈伤组织中紫杉醇的含量在接种后一直下降 ,至 15 d 时降至最低值 ;之后逐渐增加 ,在 30 d 时达 到最高值 (0. 036 %) ;以后又呈下降趋势 (图 1) .2. 2 悬浮细胞生长和紫杉醇积累动态 愈伤组织接入液体培养基中 1 d 后 , 培养液开始变成棕 红色 ,至第 7 d 时红色较深 ; 第二代 、第三代和第 四代的培养液均有变红现象 ,但程度逐次减轻 ;至第五代时 ,培养液和细胞呈淡黄色 ,细胞大都为小米大小的团粒状. 细胞中紫杉醇含量在前 4 代中 随继代次数增加而下降较多 ; 4 代以后则相对比 较稳定 (表 1) .在液体培养基中 ,云南红豆杉细胞的生长周期变短 ,为 18 d (图 2) . 在培养过程中 ,细胞干 重的增加可大致分为延迟期 (接种 6 d) 、快速生 长期 (第 6 d 至第 15 d) 、减慢期 (第 15 d 至第 18图 1 云南红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇积累动态fresh weight dry weight taxol content表 1 不同继代次数云南红豆杉悬浮细胞中紫杉醇的含量继代次数123456紫杉醇含量%0. 027 2 0. 023 6 0. 020 4 0. 018 8 0. 017 9 0. 018 2d) 和下降期 (第 18 d 以后) . 在生长周期内 ,细胞干重最多可增加 1 . 44 倍 ,增倍期为 12 d 左右. 悬浮细胞利用蔗糖的速率比较高 ,至 18 d 时 ,培养基中的蔗糖被消耗殆尽. 细胞干重的增加与糖的消耗密切相关(图 2) .在培养周期中 ,悬浮细胞中紫杉醇含量的变化动态与愈伤组织的是一致的 : 接种后含量一直下降 , 在第 12 d 降至最低值之后开始逐渐增加 ,到 21 d 时达到最高值 (0 . 0175 %) ,以后又下降 (图 2) . 但悬浮 细胞的紫杉醇含量变化幅度要比愈伤组织的小得多. 在悬浮培养过程中 ,紫杉醇产量的变化同细胞生长 的变化一致 :接种后一直呈上升趋势 ,在第 18 d 时达到最大值 (3 mgL - 1 ) .本试验中云南红豆杉细胞所合成的紫杉醇几乎都在胞内 ,培养液中紫杉醇的含量极低. 在培养后的 18 d内培养基中未测出紫杉醇 ,第 21 d 和第 24 d 的培养基中紫杉醇含量分别仅为 0. 011 mgL - 1 和 0. 014 mgL - 1 . 368 湖北大学学报 (自然科学版) 第 23 卷图 2 云南红豆杉悬浮细胞生长和紫杉醇积累动态(a) 细胞干重和糖浓度随培养时间的变化 ; ( b) 紫杉醇含量和产量随培养时间的变化2 . 3培养基中 NO - 和 NH+ 的浓度对愈伤组织和细胞生长及紫杉醇含量的影响在以 NH + 为唯一无344机氮源的基 ( T1) 上 ,愈伤组织在接种 7 d 后变成了砖红色 ,以后增殖较少 ,其干重显著低于对照 ,但紫杉醇含量却显著地高于对照 (表 2) . 提高培养基中 NO - 浓度有利于愈伤组织的生长 ,当 NO - 浓度和 NH +334浓度各占一半 (处理 T2) 时 ,愈伤组织的生长同对照没有显著的差别 ,但紫杉醇含量仍显著地高于对照.处理 T3 为补加了 3 600 mgL - 1 KCl 的对照培养基 ,其 Cl + 浓度与对照相同. 在此培养基上 ,愈伤组织的颜 色和生长速率与对照的相似 ,但紫杉醇含量却显著高于对照. 通过比较对照 T1 和 T3 愈伤组织的生长情 况和紫杉醇含量可知 ,T1 的效应主要不是由于 Cl + 浓度高所致.培养基中 NO -和 NH+ 的浓度对云南红豆杉愈伤组织和细胞生长及紫杉醇含量的影响表 234NO - NH +收获干重(gL - 1 )紫杉醇含量干重%紫杉醇产量(mgL - 1 )3 4处理干重增长指数(m molm mol)24. 82. 00. 026. 813. 413. 424. 82. 0对照T1T2T39. 81 1. 447. 00 0. 688. 55 1. 319. 63 1. 561. 432 0. 2510. 877 0. 230 3 31. 156 0. 1931. 418 0. 1670. 0213 0. 00140. 0572 0. 0010 3 30. 0259 0. 00410. 0294 0. 0081 3 32. 094. 002. 212. 83Data =X S E , n = 6 for growth data and 3 for taxol contents. t - test : P 0. 01在悬浮细胞快速生长的中后期 ( 第 12 d) ,用无机氮全为铵态氮的增殖培养基更换原有培养基 4 d后 ,细胞和培养基开始变红 ,至 7 d 后收获时培养物已成砖红色 ,细胞的干重略有增加 ,但紫杉醇含量和 产量分别比对照提高了 131 %和 162 % ,达 0 . 042 %和 8 . 5 mgL - 1 .3讨论在本试验中 ,云南红豆杉愈伤组织的干重和鲜重的增加均无明显的延迟期 . 这可能是因为取样的时间间隔较长 (5 d) 和用了生长旺盛期的愈伤组织 (继代后 20 d 的愈伤组织) 作试验材料的缘故. 从其生长 进程曲线 (图 1) 可以看出 ,继代后 20 d 的愈伤组织仍处在快速生长阶段. 用此阶段的愈伤组织进行继代 ,其延迟期必然会短.同固体培养相比 ,悬浮培养时云南红豆杉细胞的生长周期变短 , 约为 18 d. 这显著低于 Srinivasan等3的欧洲红豆杉细胞系 (25 d) 和 Fett - Neto 等2 的东北红豆杉细胞系 (30 d) . 在培养周期中 ,本细胞系的生长速率和利用培养基中蔗糖的速率与 Fett - Neto 等2 的东北红豆杉细胞系相近 , 而与 Srinivasan等3的欧洲红豆杉细胞系相差较大. 后者在一个培养周期中 ,细胞干重可增加 18 倍 ;在 20 gL - 1 蔗糖的- 13B5 培养基中培养 10 d 后 ,培养基中糖的浓度仍有 17 gL. Srinivasan 等 的细胞系增长倍数高和蔗糖利用速率低很可能与其接种量小 (约 0 . 5 gL - 1 干细胞) 有关. 本试验中的细胞系在接种量低 (4 . 35 gL - 1 干 细胞) 时几乎不长 ,约 1 周后就转成深褐色而死亡 .在快速生长期的中 、后期以前 ,云南红豆杉愈伤组织和悬浮细胞中紫杉醇的含量都呈下降趋势 ; 自 快速生长期中 、后期开始 ,愈伤组织的细胞中紫杉醇含量才开始增加. 这表明在接种后到快速生长期的 中 、后期这段时间内 ,愈伤组织和细胞的干重增加速率大于其紫杉醇的合成速率 ; 新增殖的愈伤组织和 细胞需要经过一段时间的生长后 ,才具有较强的紫杉醇合成能力. 我们在进行杂种红豆杉愈伤组织培养 时也得到类似的结果 (资料未发表) .细胞悬浮培养是实现工业化生产有用物质的必经之路 ,而且液体培养时细胞的生长和代谢更易调 节 . 但云南红豆杉细胞对培养方式的改变比较敏感. 当由固体培养转入液体培养基后 ,在代谢上产生了 一些显著变化 ,如有色物质合成和分泌能力增强 、紫杉醇合成能力下降 ,其原因值得进一步研究.对于云南红豆杉细胞的生长来说 ,硝态氮远远优于铵态氨 ,但对于其紫杉醇的形成来说 ,则正好相 反 . 这与我们在另一个云南红豆杉细胞系 TY8 上得到的结果一致9 . 这一结果表明 ,可用两步法来提高云南红豆杉悬浮细胞的紫杉醇产量 :前阶段使用促进细胞生长的含硝态氮的培养基 ,在后阶段更换为有 利于紫杉醇合成的含铵态氮的培养基 . 本试验的结果证明了这一点.参考文献 :陈永勤 ,朱蔚华 . 红豆杉属植物愈伤组织 、细胞和胚培养 J . 植物生理学通讯 ,1997 ,33 (3) :213219.Fett - Neto A G ,Zhang W Y ,DiCosmo F. Kinetics of taxol production ,growth ,and nutrient uptake in cell suspensions of Tax us cus2pidata J . Biotechol Bioeng ,1994 , 44 :205210.Srinivasan V ,Pestchanker L . Moser S ,et al . Taxol production in bioreactors : kinetics of biomass accumulation , nutrient uptake and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata J . Biotechnol Bioeng ,1995 , 47 :666676.罗建平 ,牛炳韬 ,贾敬芬 . 云南红豆杉愈伤组织培养 J . 生物工程学报 ,1997 ,13 :326329.陈永勤 ,朱蔚华 ,吴蕴祺 ,等 . 不同种类红豆杉愈伤组织的诱导及紫杉醇含量的差异 J . 中草药 ,2000 ,31 :216218.陈永勤 ,朱蔚华 ,吴蕴祺 ,等 . 几种真菌诱导子对云南红豆杉细胞生产紫杉醇的影响 J . 生物工程学报 ,1999 ,15 (4) :522524.袁晓华 ,杨中汉 . 植物生理生化试验 M . 北京 :高等教育出版社 ,1983. 911.Wu Y Q ,Zhu W H. High performance liquid chromatographic determination of taxol and related t ax anes from Taxus callus culturesJ . J Liq Chromatgr & Related Technol ,1997 , 20 :31473151.陈永勤 ,朱华 ,吴蕴祺 ,等 . 组培条件对云南红豆杉愈伤组织生长和形成紫杉醇的影响 J . 中国中药杂志 ,2000 ,25 :269272.123456789Cell culture of Ta xus yu n na ne nsis and taxol productionChen Yongqin ,Zhu Weihua ,Wu Yunqi , Hu Qiu(1. School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 ,China ;2. Institute of Materia Medica ,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College ,Beijing 100050 ,China)Abstract : The growth and taxol accumulation kinetics of the cells of Tax us y unnanensiscultured in both solid and liquid medium and the effects of inorganic nitrogen forms in mediu