分子生物学课件5.DNA复制.ppt

Furthermore WatsonandCrickissuedthe CentralDogma tofaithful WhichdecreedthatgeneticinformationflowslinearlyfromDNAtoRNAtoprotein andneverinreverse 1953年 Watson和Crick提出DNA分子的双螺旋模型 合理揭示了DNA复制和转录过程 1958年 Crick在 论蛋白质合成 一文中 以其远见卓识提出了中心法则 DNA Replication RNA Protein Translation Transcription Thisistheoriginalcentraldogma itformsthebackboneofmoleculebiologyandispresentedbyseveralstages Replication transcription processed ineukaryoticcells essentiallybysplicing andtranslation processed CentralDogma Reversetranscription RNAediting RNAreplication 5 DNA复制DNAReplication Duplication DNA是生物遗传的主要物质基础 生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子 并通过DNA的复制由亲代传递给子代 遗传信息从DNA转录给RNA 然后再翻译成特异的蛋白质 以执行各种生物功能 5 1DNA复制的特点TheCharacteristicsofDNAReplication 5 1 DNA复制的半保留性DNA复制的半不连续性复制起点 ori区 序列十分保守 RNA引物思考 DNA通过自身复制 怎样维持遗传的稳定 即DNA复制的高度忠实性是怎样实现的 5 2参与DNA复制的酶体系EnzymesandrelativeproteinsinDNAreplication 双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程 实际上 在复制叉进行复杂的DNA复制过程中 还需要其他许多相关的酶和蛋白因子的参与 如DNA解旋酶 DNA旋转酶 DNA单链结合蛋白 引发酶 连接酶 去除RNA引物的酶等 5 2 1DNA聚合酶及其功能DNApolymerase pol anditsfunction DNA聚合酶 DNApolymerase 是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成新DNA链的一类酶 原核和真核生物中都包含有多种DNA聚合酶的活动 只有它们中的一部分是真正参与了复制的 有的时候这些酶叫做DNA复制酶 其它的一些扮演了复制过程中的辅助角色并且或者参与了替换被破坏的序列的DNA合成的修复工作 研究最清楚的是大肠杆菌中的DNA聚合酶 已鉴定了5种不同的DNA聚合酶 分别为DNA聚合酶 和 所有的原核和真核生物的聚合酶都具有同样的合成行为的基本类型 每一个都可以通过在3 OH端一次加入一个核苷延伸DNA链 加入链中的核苷是通过和模版DNA的碱基配对来选择的 5 2 1 1DNA聚合酶催化的反应Thecatalysisreaction 以dNTP为底物 释放PPi获得能量Mg2 反应受模板指导在链的3 OH端延伸延伸方向是5 3 新DNA与模版链互补 5 2 3 OH自由端的作用DNA聚合酶需要3 OH自由端来初始DNA的合成 提供3 OH自由端的途径 一个RNA序列在模版上被合成 RNA链 RNA引物 的3 OH自由端会被DNA聚合酶延伸 这种方法通常在复制细胞DNA时被使用 也被一些病毒使用 一个事先形成的RNA和模版配对 允许它的3 OH端被用来引导DNA的合成 这种机制在反转录病毒中被用来引导RNA的反转录 一个引导点在双链DNA中产生 最常见的机制是通过引入一个切口 如同在初始滚环复制 在这种情况下 事先形成的链由新生成的链替代 一个蛋白质 C OH 可以直接引导反应 它可以直接向DNA聚合酶提供一个核苷 这种反应有若干病毒采用 5 2 2 2DNA聚合酶 DNAPol 1955年 Kornberg在E Coli中发现DNApol 分子质量为10 3万道尔顿 单一肽链组成 多肽链中含一个Zn DNApol 可被水解为一大一小两个片段 大片段 68000U 又称Klenow片段 具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 有校正功能 小片段 35000U 具有5 3 外切酶活性 切除小片段DNA RNA 如切除RNA引物 Klenow片段的结构 右手形状 手掌 手指 拇指 复制忠实性Replicatefidelity DNA复制过程中碱基配对受到双重核对 聚合酶的选择作用3 5 外切核酸酶的作用 正确碱基配对 错误碱基配对 SlowornoDNAsynthesis 几乎没有DNA合成 外切核酸酶作用位点Exonucleaseactivesite 错配碱基Mispairedlastbasepair b Removalofmismatchednucleotides 切除错配碱基 c ResumeDNAsynthesis 修复DNA合成 5 2 2 3DNA聚合酶 DNApol 1970 1971年 Korn berg和Gefter先后分离出了DNA聚合酶 和 DNA聚合酶 是由多个亚基组成的蛋白质 亚基很容易解离 全酶由10个亚基构成 含有Zn原子 夹子装置器 DNA聚合酶 全酶的亚基组成 dimer 滑动夹子 和 2 和 夹子装置器 DNA聚合酶全酶 亚基二聚体构成一个滑动的夹子 夹住DNA分子相对滑动 使聚合酶在完成复制前不脱离模板DNA而持续聚合 DNApol 复杂的亚基结构使它具有更高的保真性 fidelity 协同性 cooperativity 和持续性 processivity 长号模型 Trombonemodel 5 2 3DNA连接酶DNAligase DNA聚合酶只能催化多核苷酸的延长反应 不能使链的两个末端间共价连接 1976年不同实验室同时发现了DNA连接酶 这个酶催化双链DNA切口处的5 磷酸基和3 OH生成磷酸二酯键 反应需要能量 DNA连接酶的催化反应DNAligase NAD ATP 酶 AMP复合物 DNAAMP DNA 相邻3 OH对活化的磷原子发生亲核攻击 AMP3 5 磷酸二酯键 5 2 4引物合成酶Primase 引物合成酶 Primase 又称为引发酶 基因dnaG的产物 inE Coli 是一种特殊的RNA聚合酶 以单链DNA为模板合成互补于DNA链的RNA引物 合成方向是5 3 不需要特异的DNA序列 引物的长度通常为几个核苷酸至10个核苷酸 5 2 5RNA消化酶RNase 在DNA复制完成时 必须去除RNA引物 这个过程需要RNase 或DNA聚合酶 的5 3 外切酶活性 去除RNA引物 DNA聚合酶填补缺口 DNA连接酶缝合切口 缺口 失去一段单链称为缺口 gap 切口 失去一个磷酸二酯键称为切口 nick 5 2 6拓扑异构酶Topoisomerase 天然环状DNA分子一般以负超螺旋构象存在 易于解链 DNA复制 重组 转录等过程都需将两条链解开 并且生物学过程需要各不相同的负超螺旋程度 可以通过DNA的拓扑结构来调节其功能 DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶来实现的 Topoisomerase 共有两种类型 TOP 使双链超螺旋DNA转变为松弛型环状DNA TOP 在复制叉前一段DNA断开一个磷酸二酯键 使DNA链断开 使得断开的DNA链可绕着另一条完整的DNA链自由转动 最后再由TOPI重新连上磷酸二酯键 影响转录活性 TOP 使松弛型环状DNA转变为负超螺旋DNA 又称促旋酶 TOP 同时断开DNA的双链 形成暂时的断裂 然后再与一个双链DNA结合封上断口 在复制叉处消除由于DNA解螺旋而产生的超螺旋 与复制有关 大肠杆菌中的DNA旋转酶 gyrase 又称拓扑异构酶 Topoisomerase 由四个亚基组成四聚体 2 2 而真核生物的呈 二聚体 5 2 7解旋酶和单链结合蛋白Helicase SSB 由拓扑异构酶 引入的负超螺旋 削弱了复制叉前进产生的扭曲张力 协助DNA解旋酶 DNAhelicase 促进解链 单链结合蛋白 single strandDNAbindingproteins SSB 结合产生的单链DNA singlestrandDNA ssDNA 上防止出现单链的链间或链内局部退火 保证产生的单链DNA处于稳定状态 DNA解旋酶 DNAhelicase 的作用 SSB结合ssDNA 原核细胞中SSB同ssDNA的结合是一种协同结合 无序列专一性 是一种静电作用 大肠杆菌的SSB蛋白有4个相同的亚基组成 5 3原核生物DNA复制 大肠杆菌为例 theDNAreplicationinE coli DNA合成的生长点即复制叉上分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子 他们构成的复合物称为复制体 replisome DNA复制的过程表现在其复制体结构的变化上 大肠杆菌染色体DNA的复制过程分为三个阶段 起始 延伸和终止 其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同 5 3 1DNA复制的起始InitiationofDNAreplication 所有的DNA复制通常是从双螺旋的特定位置 复制起点开始 DNA复制起点是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列 又称复制原点 origin E coli的Origin的识别特点 三个富含A T的13bp序列和四个9bp重复序列 DnaA蛋白结合位点 HUATP DnaA HumakesDNAbend DnaB helicase DnaC helicaseloader 13bp9bp 复制起始分子机制 六个步骤 DnaA ATP Hu识别 结合9bp重复序列 Hu使DNA双链弯曲 DnaB DnaC蛋白复合体结合解链区 SSB结合单链DNA DnaB打开DNA双螺旋 DNAprimase DnaG DNApol 滑动夹子 复制起始酶体系 OriC处的复制起始从一个需要起码6种蛋白质 DnaA DnaB DnaC HU DnaG SSB等 的复合物的形成开始 DnaG合成RNA引物 DNApol结合DNA DnaB和DnaC蛋白形成一个复合物 其中6个DnaC单体与每一个DnaB六聚体结合 这行成了一个480KD的蛋白复合体 相当于一个半径6nm的球 在oriC处形成的复合物以一个可见的大蛋白颗粒形式被发现 利用电镜可探测到复制原点C处的蛋白复合体 两个可见的复合体都是采用DnaB蛋白抗体标记显示的 大肠杆菌起点与复制起始有关的酶与辅助因子 5 3 2DNA复制的延伸ElongationofDNAreplication 复制的延伸阶段同时进行着前导链和滞后链的合成 前者持续合成 后者分段合成 协调滞后链和前导链的合成 前导链和滞后链上的DNA聚合酶在同一位点起始 滞后链 前导链 DNA聚合酶以相反方向移动并在冈崎片断合成后分开 滞后链上的DNA聚合酶相对于DNA有一个位移 核心聚合酶和 夹板在冈崎片段合成结束时脱落 并且在起始点重新结合 当一个Pol 全酶遇到一个DNA切口时 核心复合物和夹板会从 滑动夹板上脱落 核心可以在别的地方和一个新的 子基重新结合 5 3 3DNA复制的终止TerminationofDNAreplication 细菌环状染色体的两个复制叉不断向前推移 最后在终止区相遇并停止 该区含有多个约22bp的终止子 terminator 位点 两个复制叉在终止区相遇后停止复制 复制体解体 两个环状染色体互相缠绕 成为连锁体 此连锁体在细胞分裂前必须解开 否则将导致细胞不能分裂而死亡 连锁体 终止解链 旋转合成 解连锁拓扑异构酶 变性 修复合成 连锁体 5 4真核生物DNA复制DNAReplicationinEukaryotes 真核生物DNA复制研究较为详细的主要有猿猴病毒 SV40 酵母细胞和非洲爪蟾的卵细胞 5 4 1真核生物DNA复制的特点theCharacteristic 真核生物的DNA缠绕在组蛋白核心上 形成核小体真核生物染色体有多个复制起点5 氟脱氧尿苷是真核细胞DNA复制的强抑制剂复制速度较原核生物慢 5 4 2真核生物DNA聚合酶DNApolofEukaryotes 真核生物有多种DNA聚合酶 在哺乳动物中分离了5种 分别以 来命名 5 4 3真核生物染色体DNA复制EukaryoticchromosomeDNAreplication 真核生物染色体DNA的复制严格遵循每个细胞周期DNA只复制一次的原则 并在复制起始前会形成一个前起始复合体 Pre replicativecomplex Pre RC 复制起点真核生物复制起点称为自主复制序列 ARS 或复制基因 replicator 有一个蛋白复合体可结合其上 称为起点识别复合物 originrecognitioncomplex ORC或initiator 激活复制的起始 前起始复合体的形成G1期时 ORC Initiator 识别 结合replicator 多种蛋白共同参与在replicator处形成前起始复合体 Pre replicativecomplex Pre RC pre RC 激活复制起始细胞进入S期 pre RC被Cdk和Ddk两种蛋白激酶激活 形成有活性的起始复合体 开始复制 细胞周期对CdK蛋白活性的调控及前起始复合体形成的调节 5 4 4端粒复制Telomerereplication 端粒 telomere 真核生物染色体两端具有的特殊结构 真核生物线性染色体在复制后 不能像原核生物那样填补5 端的空缺 从而会使5 端序列变短 而端粒酶 telomerase 可以外加重复单位到5 段上 维持端粒一定长度 端粒酶是RNA与蛋白组成的一种核糖核蛋白 RNP 复合体 是一种反转录酶 以其所含有的RNA为模板合成DNA端粒的结构 它所含的RNA约长150bp 并约含1 5拷贝的CyAx重复序列 是合成端粒TyGx的模板 5 3 5 5DNA复制调控DNAReplicationControl DNA的复制是受调控的 复制的调控发生在起始阶段 从复制原点起始一轮DNA复制 特异蛋白质因子对原点的识别和结合是关键的一步 生物体中所有的细胞都是将基因组复制与细胞周期相互协调 一个细胞周期中DNA复制一次 以阻止DNA的丢失或过剩 5 5 1大肠杆菌中DNA复制调控DNAReplicationcontrolinE coli l染色体的复制与细胞分裂一般是同步的 但不直接相偶联 l大肠杆菌的复制起点由oriC和oriH两种 DNA复制的调节主要发生在起始阶段 一旦开始复制 如无意外受阻 就一直复制到完成 复制子 Replicon 基因组中一个能被独立复制的DNA片段单位 其中含有复制起驶点 在细菌和质粒DNA中只含有一个复制子 复制子的复制方式取决于发生在起始阶段的内部作用的实质 普遍原则是复制在起始阶段被控制 一旦复制开始 它就会持续下去直到整个基因组被复制 起始率是由调节蛋白与结合位点的内部作用来控制的 甲基化对复制的调控 细菌 或质粒 复制原点的什么特征保证了它在每一循环只起始复制一次呢 起始是与一些改变相连 这些改变在复制原点作标记 所以已复制的复制原点与未复制的复制原点能够加以区别吗 E Coli中主要是通过对模板链的甲基化来区分新合成的DNA链 模板DNA的oriC包含GATCCTAG这一序列的11个拷贝 它是甲基化的靶序列 Dam甲基化酶使腺嘌呤A的N6位置被甲基化 甲基化的DNA复制产生半甲基化DNA 直至Dam甲基化酶将其全甲基化 一个半甲基化的复制原点不能被用来起始一个复制循环 完全甲基化的复制原点可起始复制 半甲基化的子代复制原点只有恢复完全甲基化状态之后才可被继续利用 多复制子真核生物DNA复制的调节比原核生物更为复杂 真核生物细胞有多条染色体 每一条染色体上有多个复制起点 是多复制子的复制 在一个分裂周期 每一个复制子的复制起点都只被激活一次 它们通常是只在复制起点作用一次或者通过一个抑制物阻止已经被使用过的复制起点的再次复制 5 5 2真核生物DNA复制调控ReplicationControlinEukaryotes 系统如何认定任何一个特殊的复制起点是否已经被复制过了 哪些蛋白质元素与此相关 非洲爪蟾 Xenopus 卵细胞具有所有的复制DNA所需要的成分 在孵化开始的几个小时里它们会经历11个分裂周期而没有新的基因表达 它们还可以复制注入卵内的DNA 执照因子 Licensingfactor 它在复制前存在于细胞核内 复制一次后这种蛋白或者失效或者完全被破坏 除非再提供这种因子 否则就不能进行下一轮的复制 在细胞质中的因子只有在下一个有丝分裂时 当核膜破裂时才能有机会进入核内 这个调控系统达到了两个目的 通过在复制之后去除一个必要的成分 阻止了一周期内的多次复制 而且它提供了反馈循环 使得复制的初始化依赖于细胞分裂的发生 执照因子 特许因子 Licensingfactor 它在复制前存在于细胞核内 复制一次后这种蛋白或者失效或者完全被破坏 除非再提供这种因子 否则就不能进行下一轮的复制 在细胞质中的因子只有在下一个有丝分裂时 当核膜破裂时才能有机会进入核内 复制由时间控制 并非所有起点都在同一时间被激活 而是有先后 通常活性区先复制 异染色质区晚复制 真核生物没有复制终止子 真核细胞DNA复制有三个水平的调控 细胞生活周期水平的调控 决定细胞停留在G1期还是进入S期 染色体水平复制调控 决定复制子按一定顺序在S期起始复制 复制子水平调控 决定复制起始与否 Summary DNA是生物遗传的主要物质基础 生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子 并通过DNA的复制由亲代传递给子代 遗传信息从DNA转录给RNA 然后再翻译成特异的蛋白质 以执行各种生物功能 DNA复制的特点 DNA复制的半保留性 DNA复制的半不连续性 复制起点 RNA引物 双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程 DNA聚合酶不能够从自由的核苷开始初始化DNA链的合成 总是需要一个引物提供一个自由的3 OH端 才可以加入新的核苷 可以通过多种途径位DNA聚合酶催化地反应提供自由的3 OH端 实际上 在复制叉进行复杂的DNA复制过程中 还需要其他许多相关的酶和蛋白因子的参与 如DNA解旋酶 DNA旋转酶 DNA单链结合蛋白 引发酶 连接酶 去除RNA引物的酶等 DNA复制忠实性通过两种机制来实现 DNA合成是专一位点激活的催化反应