分子生物学研究法上.ppt

1 第5章分子生物学研究法 上 DNA RNA及蛋白质操作技术5 1重组DNA技术史话5 2DNA基本操作技术5 3RNA基本操作技术5 4基因克隆技术5 5蛋白质与蛋白质组学技术 2 从20世纪中叶开始 分子生物学研究得到高速发展 主要原因是研究方法 特别是基因操作和基因工程技术的进步 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核酸序列分析以及基因人工合成 定点突变和PCR扩增等 是分子生物学研究的核心技术 基因工程是指在体外将核酸分子插入载体分子 构成遗传物质的新组合 使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达 基因工程技术是核酸操作技术的一部分 强调外源核酸在另一种寄主细胞中的繁衍与性状表达 3 5 1重组DNA技术史话 分子生物学研究的起步主要表现在3个方面 在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质 解决了遗传的物质基础问题 在20世纪50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制 解决了基因的自我复制和世代交替问题 在20世纪50年代末至60年代 相继提出了 中心法则 和操纵子学说 成功地破译了遗传密码 阐明了遗传信息的流动与表达机制 4 但当时缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术 而无法对这类物质进行直接的生化分析 随着DNA分子体外切割与连接及核苷酸序列分析技术的进步 推动了重组DNA技术的产生与发展 重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接 工具酶的发现与应用是现代生物工程技术发展史上的重要事件 见P167表5 1 将外源DNA和载体分子重组成杂种DNA分子后 还必须通过转化过程将其导入到新寄主细胞中 才能保证重组DNA分子的增殖 5 6 7 5 2DNA基本操作技术 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术 已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段 核酸凝胶电泳是现在通用的分子生物学研究方法 是DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础 凝胶的分辨率与凝胶的类型和浓度有关 P174表5 2 在凝胶电泳中 一般要加入溴化乙锭 EB 染色 EB染色后的核酸分子在紫外光下发出荧光 5 2 1核酸凝胶电泳 8 核酸凝胶电泳的基本原理 某种分子在特定的电场中 就会以一定的速度向适当的电极移动 某物质在电场作用下的迁移速度称为迁移率 迁移率与电场强度成正比 与该分子所携带的净电荷数成正比 而与分子的磨擦系数成反比 分子大小 极性 介质的粘度系数等 生理条件下 核酸分子中的糖 磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态 把核酸分子放置在电场当中 将会向电场的正极方向迁移 普通凝胶电泳只能进行DNA小片段分离 应用脉冲电场凝胶技术可进行超大DNA片段的分离研究 9 10 11 12 5 2 2细菌转化 细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株 接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞 细菌转化常用的方法 CaCl2法和电击法 CaCl2法 将快速生长中的大肠杆菌置于经低温 0 预处理的低渗氯化钙溶液中 造成细胞膨胀 膜通透性改变 电击法 锐利的电脉冲可在细胞膜上造成小凹陷 再形成孔洞 13 5 2 3聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应 PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 PCR体系的基本组成 超纯水 缓冲液 Mg2 dNTP DNA模板 引物 TaqDNA聚合酶 PCR的主要步骤 3步多次循环 变性 90 96 在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂 形成单链DNA 称之为变性 退火 25 65 是模板与引物的复性 引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段 延伸 70 75 结合在特定DNA模板上的引物为出发点 将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5 3 的方向沿着模板顺序合成新的DNA链 14 15 5 2 4实时定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法称为实时定量PCR 常规PCR技术无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数称为Ct值 荧光标记方式 非特异性荧光标记 SYBRGreen 和特异性荧光标记 TaqMan 16 5 2 5重亚硫酸盐测序技术 表观遗传 基因的DNA序列不发生改变的情况下 基因的表达水平与功能发生改变 并产生可遗传的表型 表观遗传学 是研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时 基因功能的可逆的 可遗传的改变 特征 可遗传 可逆性 DNA不变 表观遗传学的现象 DNA甲基化 组蛋白修饰 微小RNA 基因印记 DNA甲基化是指生物体在甲基转移酶的催化下 以S 腺苷甲硫氨酸为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程 17 甲基化的主要形式有5 甲基胞嘧啶 6 甲基腺嘌呤 7 甲基鸟嘌呤 真核生物主要发生于胞嘧啶 DNA甲基化能引起染色质结构 DNA构象 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变 而参与调控许多重要的生物学现象和发育过程 DNA甲基化将会抑制基因表达 DNA的CpG序列在动物基因组的某些区域密度比较高 形成CpG岛 哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛 CpG岛常位于基因启动子区或第一个外显子区 只有CpG岛中的胞嘧啶能被甲基化 肿瘤发生时 抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加 而CpG岛中则呈高甲基化状态 18 实验中常用重亚硫酸盐测序法来确定某个碱基位点的甲基化情况 其主要过程 见P182图5 15 将待测DNA样品用限制性内切核酸酶处理 或用超声波破碎成500 1000bp的碎片 重亚硫酸盐处理使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶 C 发生脱氨基作用转变成尿嘧啶 U 甲基化后的胞嘧啶不受影响 PCR扩增后的尿嘧啶 U 被测序仪读取为胸腺嘧啶 T 对引物的选择和设计要求非常高 参考原始序列即可判断原C位点是否甲基化 未甲基化的C经处理后成T 甲基化的C不变 19 5 2 6基因组DNA文库的构建 从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段 分别与载体连接 转入受体细菌或细胞 形成克隆 每一个细胞接受了含有基因组DNA中的某个片段与载体连接的重组DNA分子 而且可以繁殖扩增 许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体 就称为基因组DNA文库 基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断 分析特定基因结构 研究基因表达调控 还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定 20 21 5 3RNA基本操作技术 细胞总RNA包括mRNA rRNA tRNA sRNA 典型动物细胞中 mRNA1 5 rRNA80 85 tRNA15 20 实验室常用Trizol试剂提取总RNA Trizol是一种新型总RNA抽提试剂 能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶 主要成分是苯酚 用来裂解细胞 还加有8 羟基喹啉 异硫氰酸胍 巯基乙醇等 用来抑制内源和外源RNase 5 3 1总RNA的提取 22 将组织在液氮中磨碎 每50 100mg组织加入1mlTRIzol 用匀浆仪进行匀浆处理 将匀浆样品在室温 15 30 放置5分钟 使核酸蛋白复合物完全分离 每使用1mlTRIzol加入0 2ml氯仿 振荡15秒 室温放置3分钟 2 8 10000 g离心15分钟 样品分三层 底层为黄色有机相 RNA在上层水相中和一个中间层 水相转移到新管中 每使用1mlTRIzol加入0 5ml异丙醇 沉淀水相中的RNA 室温放置10分钟 2 8 10000 g离心10分钟 离心后在管侧和管底出现胶状RNA沉淀 弃上清 用75 乙醇洗涤RNA沉淀 每1mlTRIzol加1ml75 乙醇 2 8 不超过7500 g离心5分钟 弃上清 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀 23 5 3 2mRNA的纯化 利用mRNA3 端含有poly A 的特点 当mRNA流经寡聚 dT 纤维素柱时 在高盐缓冲液作用下 mRNA被特异的吸附在寡聚 dT 纤维素上 再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA 经过两次寡聚 dT 纤维素柱 可得较纯的mRNA 纯化mRNA在70 乙醇中 70 可保存一年以上 24 5 3 3cDNA的合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板 反转录为cDNA 由反转录酶催化 该酶合成DNA时需要引物引导 常用引物是寡聚 dT 寡聚 dT 引物一般含12 20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸 后面再加一个连接引物 常为Xho 酶切位点 以便于克隆构建 第二链cDNA的合成以第一链为模板 由DNA聚合酶催化 25 26 5 3 4cDNA文库的构建 cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合 基本步骤 提取总RNA 在获得高质量的mRNA后 反转录合成cDNA 合成接头的加入 将双链DNA克隆到载体中去 分析cDNA片断 扩增cDNA文库 对建立的cDNA文库进行鉴定 27 5 3 5基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子特定克隆的过程 筛选方法有很多种 常用的有 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法 核酸杂交法常用放射性标记的特异DNA探针进行高密度的菌落杂交筛选 见P189图5 21 PCR筛选法在已知序列信息并获得基因特异引物时 用PCR筛选法比较简单 免疫筛选法基于抗原抗体特异性结合的原理 利用表达载体所编码的蛋白质进行免疫筛选 28 5 4基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上 人们用克隆 clone 表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体 从同一受精卵分裂而来的单卵双生子便是属于同一克隆 在细胞水平上 克隆一词是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体 在分子生物学上 把外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中 使之得以永久保存和复制 这种过程称为克隆 29 5 4 1RACE技术 cDNA末端快速扩增法 RACE 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法 根据已知序列设计基因片段内部特异引物 由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列 用于扩增5 端的方法称为5 RACE 用于扩增3 端的称为3 RACE 已知cDNA序列可来自序列表达标签 减法cDNA库 差法显示和基因文库筛选 30 5 RACE在反转录酶的作用下 以已知基因片段内部特异性引物 GPS1 启始cDNA第一条链的合成RNase降解模板mRNA 纯化cDNA第一条链 用末端转移酶在cDNA链3 端加dC 形成寡聚 dC 尾巴 以连有寡聚 dG 的锚定引物 AP 和基因片段内部特异引物 GPS2 进行PCR扩增 以期得到目的基因5 端片段 31 3 RACE在反转录酶的作用下 以连有可以和polyA配对的寡聚 dT 的锚定引物启始cDNA第一条链的合成 RNaseH降解模板mRNA 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增 以期得到目的基因3 端片段 32 5 4 2应用cDNA差示分析法克隆基因 cDNA差示分析法 RAD 充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板 仅以线形形式扩增单链模板的特性 通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法 特异性扩增目的基因片断 试验材料 TesterT 和探针材料 DriverD 在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理 形成平均长度256bp的代表群 保证绝大部分遗传信息能被PCR扩增 每次T减D反应后仅设置72 复性与延伸 94 变性这两个参数共20个PCR循环 PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高 33 34 5 4 3Gateway大规模克隆技术 Gateway基因大规模克隆法利用 噬菌体进行位点特异性DNA片段重组 实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移 为大规模克隆基因组注释的可读框提供了保障 Gateway克隆技术包括TOBO反应和LR反应 TOBO反应将目的基因连入Entry载体 见P194图5 25a LR反应将目的基因片段从Entry载体重组到表达载体 见P194图5 25b 35 5 4 4基因的图位克隆法 基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一种好方法 从理论上说 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到 首先 通过构建遗传连锁图 将目的基因定位到某个染色体的特定位点 并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记 其次 利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针 通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来 再根据基因功能互作原理鉴定目的基因 36 染色体步移 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆 如此得到的阳性克隆是 一步克隆 利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交 得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为 二次克隆 如此反复即可取到需要的克隆 获得目的基因 37 5 5蛋白质与蛋白质组学技术 蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的 蛋白质组学研究成功与否 很大程度上取决于其技术方法水平的高低 蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难 蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析 往往要同时处理成千上万种蛋白质 发展高通量 高灵敏度 高准确性的研究技术平台