第二章蛋白质化学1(2014年-2015年第一学期)

第二章蛋白质化学 第二章蛋白质化学 学习要求 氨基酸 肽 蛋白质分子构象 蛋白质的概念 分类和功能 蛋白质的理化性质 氨基酸及蛋白质的分析和分离 蛋白质结构与功能的关系 学习要求 1 蛋白质生物功能 分类 2 氨基酸分类 结构 重要化学反应和分离 分析方法 重点弄清楚它的两性性质 pI和pk 4 蛋白质的重要理化性质 3 弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法 掌握二 三和四级结构特点及维持蛋白质结构稳定的作用力 5 蛋白质分离 纯化方法及其理论依据 第一节蛋白质的概念 分类和功能 一 蛋白质的概念 二 蛋白质的分类 三 蛋白质的功能 一 蛋白质的概念 蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物蛋白质是生命的物质基础英文名称protein 是 最原初的 第一重要的 意思 是由20种L型 氨基酸组成的生物大分子 占人体干重的45 最简单的单细胞 大肠杆菌 每个菌体约有3000种不同的蛋白质机体的新陈代谢的全部化学反应均有蛋白质 酶 的参与 二 蛋白质的分类 1 根据蛋白质分子的组成成分分类2 根据溶解度分类3 根据分子形状分类4 根据蛋白质的生物学功能分类 1 根据分子形状分 球状蛋白 纤维状蛋白 2 根据功能分 活性蛋白 结构蛋白 3 根据组成分 1 简单蛋白质 清蛋白 球蛋白 谷蛋白 醇溶谷蛋白 组蛋白 精蛋白 硬蛋白 2 结合蛋白质 色素蛋白 金属蛋白 磷蛋白 核蛋白 脂蛋白 糖蛋白 二 蛋白质的分类 三 蛋白质的功能 1 生物催化功能2 结构功能3 转运功能4 运动功能5 营养和贮存功能6 调控功能7 保护和防御功能8 接受和传递信息功能 三 蛋白质的功能 酶 三 蛋白质的功能 蜘蛛网的网丝 人体的毛发等都是结构蛋白 三 蛋白质的功能 血红蛋白属于运输蛋白 三 蛋白质的功能 伸缩蛋白与结构蛋白可共同完成肌肉的运动 三 蛋白质的功能 卵清蛋白属于贮藏蛋白 三 蛋白质的功能 胰岛素 三 蛋白质的功能 免疫球蛋白属于保护蛋白 三 蛋白质的功能 某些蛋白可在细胞内和细胞间进行信号传递 第二节蛋白质的分子组成 多数蛋白质含 碳 C 50 56 氢 H 6 8 氧 O 19 24 氮 N 13 19 硫 S 0 4 有些蛋白质含有磷少数含铁 铜 锰 锌 钴 钼等个别还含有碘各种蛋白质的含氮量平均为16 第二节蛋白质的分子组成 凯氏 Kjedahl 定氮法 每克样品含氮的克数 6 25 100 100克样品中蛋白质的含量 克 第二节蛋白质的分子组成 关于奶粉中的三聚氰胺 分子式 第二节蛋白质的分子组成 关于奶粉中的三聚氰胺 各地报告患儿共6244例158人肾衰竭3人死亡 情况报告 第二节蛋白质的分子组成 含氮量很高 生产工艺简单 成本很低 给了掺假 造假者极大地利益驱动 有人估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加一个百分点 用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1 5 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末 没有什么气味和味道 掺杂后不易被发现等也成了掺假 造假者心存侥幸的辅助原因 为什么要用三聚氰胺呢 第二节蛋白质的分子组成 一 氨基酸的结构与分类 二 氨基酸的理化性质 一 氨基酸的结构通式 可变部分 各种蛋白质氨基酸的区别在于侧链R基的不同 一 氨基酸的结构与分类 二 蛋白质氨基酸的结构特点 从氨基酸的结构通式可以看出 1 除R为H 甘氨酸 外 均具有旋光性 均为L 型 2 除脯氨酸外 均为 氨基酸 三 氨基酸的分类 1 脂肪族氨基酸2 芳香族氨基酸3 杂环氨基酸 按侧链R基的化学结构特点 一氨基一羧基氨基酸有甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 含羟基氨基酸有丝氨酸和苏氨酸 含硫氨基酸有半胱氨酸和蛋氨酸 常称甲硫氨酸 一氨基二羧基氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸 二氨基一羧基氨基酸有赖氨酸和精氨酸 含酰胺基氨基酸有天冬酰胺和谷氨酰胺 1 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸1 1 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸2 1 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸3 1 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸4 1 脂肪族氨基酸 一氨基一羧基氨基酸5 1 脂肪族氨基酸 含羟基氨基酸有丝氨酸和苏氨酸1 1 脂肪族氨基酸 含羟基氨基酸有丝氨酸和苏氨酸2 1 脂肪族氨基酸 含硫氨基酸有半胱氨酸和蛋氨酸 甲硫氨酸 1 脂肪族氨基酸 1 脂肪族氨基酸 含硫氨基酸有半胱氨酸和蛋氨酸 甲硫氨酸 2个半胱氨酸通过二硫键连接形成胱氨酸 1 脂肪族氨基酸 含硫氨基酸有半胱氨酸和蛋氨酸 甲硫氨酸 一氨基二羧基氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸1 1 脂肪族氨基酸 一氨基二羧基氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸2 1 脂肪族氨基酸 二氨基一羧基氨基酸有赖氨酸和精氨酸1 1 脂肪族氨基酸 二氨基一羧基氨基酸有赖氨酸和精氨酸2 1 脂肪族氨基酸 含酰胺基氨基酸有天冬酰胺和谷氨酰胺1 1 脂肪族氨基酸 含酰胺基氨基酸有天冬酰胺和谷氨酰胺2 1 脂肪族氨基酸 2 芳香族氨基酸 芳香族氨基酸共3种苯丙氨酸 色氨酸 酪氨酸 2 芳香族氨基酸 芳香族氨基酸共3种1 2 芳香族氨基酸 芳香族氨基酸共3种2 2 芳香族氨基酸 芳香族氨基酸共3种3 3 杂环氨基酸 杂环族氨基酸共2种组氨酸 脯氨酸 3 杂环氨基酸 杂环族氨基酸共2种1 3 杂环氨基酸 亚氨基酸 杂环族氨基酸共2种2 2 根据R基团的极性 非极性R基氨基酸有丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 色氨酸和脯氨酸等8种 极性但不带电荷的R基氨基酸有甘氨酸 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 天冬酰胺和谷氨酰胺等7种 带负电荷的R基氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸 带正电荷的R基氨基酸有赖氨酸 精氨酸和组氨酸3种 非极性R基氨基酸 极性但不带电荷的R基氨基酸 带负电荷的R基氨基酸 带正电荷的R基氨基酸 3 根据酸碱性质 酸性氨基酸一氨基二羧基氨基酸 有天冬氨酸 谷氨酸 碱性氨基酸二氨基一羧基氨基酸 有赖氨酸 精氨酸 组氨酸 中性氨基酸一氨基一羧基氨基酸 除上述酸性和碱性氨基酸外 其余15种氨基酸都属于中性氨基酸 四 二十种常见蛋白质氨基酸的分类 二 氨基酸的理化性质 1 一般物理性质 2 氨基酸的酸碱性质 3 氨基酸的化学反应 1 一般物理性质 形状和味感 氨基酸都是白色晶体 各种氨基酸结晶形状不同 滋味不同 溶解性和熔点除胱氨酸和酪氨酸外 氨基酸一般都能溶于水中 但各种氨基酸在水中的溶解度差别很大 除脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中以外 所有氨基酸易溶于稀酸或稀碱溶液中 氨基酸的熔点很高 一般在200 以上 旋光性除甘氨酸外 所有天然氨基酸含有至少一个手性 碳原子 因此都具有旋光性 1 一般物理性质 光吸收性在可见光区域 20多种氨基酸都没有光吸收 但在红外区和远紫外区域 220nm 均有光吸收 由于色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸分子中R基含有苯环共轭 键系统 故在近紫外区显示特征性的吸收谱带 1 一般物理性质 酪氨酸的 max 278nm苯丙氨酸的 max 259nm色氨酸的 max 279nm 2 氨基酸的酸碱性质 氨基酸的两性解离 氨基酸的等电点 氨基酸的两性解离 氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基 在晶体状态或在水溶液中主要是以兼性离子的形式存在 氨基酸的两性解离 兼性离子亦称偶极离子 是指在同一氨基酸分子上带有能放出质子的 NH3 正离子和能接受质子的 COO 负离子 是两性离子 加酸时 H H 总电荷 氨基酸的两性解离 加碱时 总电荷 OH OH 氨基酸的两性解离 C O O C H H 3 N R C O O C H H 2 N R 完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸 侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸 它的分步解离如下 氨基酸的两性解离 其中K1和K2分别代表第一步解离 碳原子上 COOH的解离 和第二步解离 碳原子上 NH3 的解离 的 表观 解离常数 其数值为K1 Ao H A K2 A H Ao 氨基酸的两性解离 通过测定滴定曲线可以求得氨基酸的解离常数 氨基酸的两性解离 pH pK log 质子受体 质子供体 通过氨基酸的滴定曲线 当已知pK1和pK2等数据时 可以求出在任一pH条件下一种氨基酸溶液中各种离子所占的比例 氨基酸的等电点 在某一pH的溶液中 氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等 成为兼性离子 呈电中性 此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点 氨基酸的等电点 C O O C H H 3 N R C O O C H H 2 N R 在酸性溶液中 pH pI 在晶体状态或水溶液中 pH pI 在碱性溶液中 pH pI 氨基酸的等电点 丙氨酸pI的计算 C O O C H H H 3 N CH3 C O O C H H 2 N CH3 Ala Ala Ala K1 Ala H Ala Ala Ala H K1K2 Ala H Ala Ala Ala K2 H 到达等电点时 Ala Ala Ala H K1 Ala K2 H 即 K1K2 H 2两边取负对数 lg H 2 lgK1 lgK2 lg H pH lgK1 pK1 lgK1 pK2 2pH pK1 pK2令pI为等电点时的pH 则 pI pK1 pK2 2 氨基酸的等电点 天冬氨酸pI的计算 Asp Asp Asp C O O C H H 3 N CH2 C O O H C O O C H H 3 N CH2 Asp C O O C H H 2 N CH2 C O O 等电点时为Asp pI pK1 pKR 2 氨基酸的等电点 赖氨酸pI的计算 Lys Lys Lys C O O H C H H 3 N CH2 4 NH3 C O O C H H 3 N CH2 4 NH3 C O O C H H 2 N CH2 4 NH3 K1 K2 KR Lys C O O C H H 2 N CH2 NH2 等电点时为Lys pI pK2 pKR 2 氨基酸的等电点 侧链不含解离基团的中性氨基酸 其等电点是它的pK 1和pK 2的算术平均值 pI pK 1 pK 2 2同样 对于侧链含有可解离基团的氨基酸 其pI值也决定于两性离子两边的pK 值的算术平均值 酸性氨基酸 pI pK 1 pK R 2碱性氨基酸 pI pK 2 pK R 2 3 氨基酸的重要化学反应 1 与茚三酮反应2 与2 4 二硝基氟苯反应3 与异硫氰酸苯酯反应 Edman反应 1 与茚三酮反应 用途 常用于氨基酸的定性或定量分析 1 与茚三酮反应 脯氨酸及羟脯氨酸与茚三酮反应产物 N 黄色化合物 1 与茚三酮反应 AADNFB 多肽蛋白 HF DNP AADNP 多肽DNP 蛋白 原理 在弱碱性溶液中 氨基酸的 氨基很容易与DNFB作用 生成稳定的黄色DNP 氨基酸 2 4一二硝基苯氨基酸 多肽或蛋白质N 末端氨基酸的 氨基也能与DNFB反应用途 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 亦称Sanger反应 2 与2 4 二硝基氟苯反应 R CH NH2 HF NO2 F COOH R CH N COOH H pH8 9 NO2 DNP 氨基酸 2 与2 4 二硝基氟苯反应 用途 可以用来鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸 亦称Edman反应 弱碱 AAPITC 多肽蛋白 AAPTC 多肽蛋白 HF PTH AA 少一个AA的多肽或蛋白 异硫氰酸苯酯 苯氨基硫甲酰 苯乙内酰硫脲 3 与异硫氰酸苯酯反应 Edman反应 第三节肽 肽是两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接而成的聚合物 也常称为肽链蛋白质是由一条或多条多肽链构成的大分子 1 肽键与肽的结构2 天然存在的活性肽 第三节肽 1 肽键与肽的结构 CH3 CH NH2 COOH CH2OH CH NH2 COOH H2O CH3 CH NH2 CO CH2OH CH NH COOH 酰氨键 N端 C端 肽键 1 肽键与肽的结构 肽键就是由氨基酸的 羧基与相邻的氨基酸的 氨基脱水缩合起来的键 1 肽键与肽的结构 肽 氨基酸通过肽键连结起来的化合物 二肽 两个氨基酸形成的肽 三肽 三个氨基酸形成的肽 多肽 许多氨基酸形成的肽 蛋白质 多是组成氨基酸超过100个的多肽 氨基酸残基 氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水 因此表现出其分子的不完整 末端氨基和末端羧基 缩合后的氨基酸 只在肽的两端有自由的 氨基和 羧基 简称N 端和C 端 1 肽键与肽的结构 肽链的命名 根据组成的氨基酸残基来确定 规定从肽链的N 端残基开始 依次称为某氨基酰 氨基酰 某氨基酸 如 丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 NH2SerGlyTryAlaLeuCOOH NH2SerGlyTryAlaLeuCOOH 1 肽键与肽的结构 由于肽键不能自由旋转 组成肽基的4个原子和与之相连的2个 碳原子都处于一个平面内 此刚性结构的平面称为肽平面或酰胺平面 肽键平面示意图 1 肽键与肽的结构 二硫键 是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的 即胱氨酸的残基中的二硫键二硫键类型 可以使两条单独的肽链共价交联起来 链间二硫键 也可以使一条链的某一部分形成环 链内二硫键 1 肽键与肽的结构 二硫键 半胱氨酸 胱氨酸 半胱氨酸 C H N H 2 COOH C H 2 S C H N H 2 COOH C H 2 S 生物的生长 发育 细胞分化 大脑活动 肿瘤病变 免疫防御 生殖控制 抗衰老 生物钟规律及分子进化等均涉及到活性肽 生物活性肽是机体内传递信息 调节代谢和协调器官活动的重要化学信使 2 天然存在的活性肽 谷胱甘肽 由谷氨酸 半胱氨酸 甘氨酸组成 它的分子中有一个特殊的 肽键 是由谷氨酸的 羧基与半胱氨酸的 氨基缩合而成 由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化 二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽 GSSG 激素 抗生素 第四节蛋白质的分子结构 一 蛋白质的构象和维持构象的作用力二 蛋白质的一级结构三 蛋白质的三维构象四 蛋白质结构与功能的关系 一 蛋白质的构象和维持构象的作用力 1 构象与构型2 维持蛋白质构象的作用力 1 构象与构型 构象 指分子中的取代基团当单键旋转时形成的不同立体结构构型 是指立体异构分子中被取代的原子或基团在空间的取向 是给定原子之间的几何关系 如几何异构体和光学异构体 2 维持蛋白质构象的作用力 疏水作用 氢键 盐键 范德华力 二硫键 2 维持蛋白质构象的作用力 疏水作用蛋白质分子的非极性基团避开水相互聚集在一起而形成的作用力称为疏水作用 也称疏水键 氢键氢键是由极性很强的X H基上的氢原子与另一个电负性强的原子Y 如O N F等 相互作用形成的一种吸引力 盐键盐键是带相反电荷的基团之间的静电引力 也称为离子键 2 维持蛋白质构象的作用力 范德华力范德华力是一种非特异性引力 任何两个相距0 3 0 4nm的原子之间都存在范德华力 范德华力比离子键弱 二硫键二硫键是很强的共价键 由多肽链内或链间两个半胱氨酸残基的巯基氧化形成 2 维持蛋白质构象的作用力 氢键 2 维持蛋白质构象的作用力 离子键 2 维持蛋白质构象的作用力 范德华力 2 维持蛋白质构象的作用力 疏水作用 2 维持蛋白质构象的作用力 二 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序 又被称为氨基酸序列 二 蛋白质的一级结构 二 蛋白质的一级结构 我国1965年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素 三 蛋白质的三维构象 1 蛋白质分子的二级结构2 蛋白质分子的三级结构3 蛋白质分子的四级结构 1 蛋白质分子的二级结构 蛋白质的二级结构 指蛋白质多肽链主链不同肽段通过自身的相互作用 形成氢键 沿某一主轴盘绕折叠而成的局部空间结构 二级结构中具有规则构象和不规则构象规则构象 是一段连续肽单位中具有同一相对取向 可以用相同构象来表征 主要形式包括 螺旋 折叠和 转角不规则构象 主要是无规则卷曲 1 蛋白质分子的二级结构 1 螺旋 2 折叠 3 转角 4 无规则卷曲 1 螺旋 螺旋是首先被肯定的一种蛋白质空间结构基本组件最初提出 螺旋结构的是美国加州理工学院的L Pauling等人 他们在1951年研究动物毛发 角蛋白时提出此观点 1 螺旋 最常见的二级结构形式 1 螺旋 天然蛋白质以右手型螺旋为主 氢键是稳定 螺旋的主要化学键 螺旋 每个螺旋周期包含3 6个氨基酸残基 螺距为0 54nm 每个氨基酸沿螺旋轴的长度上升0 15nm 肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧 其形状 大小及电荷影响 螺旋的形成 1 螺旋 天然蛋白质以右手型螺旋为主 1 螺旋 氢键是稳定 螺旋的主要化学键 1 螺旋 螺旋构象中每一圈包含的氨基酸残基数可以是整数或非整数 每个螺旋周期包含3 6个氨基酸残基 螺距为0 54nm 每个氨基酸沿螺旋轴的长度上升0 15nm氢键是由每个氨基酸残基的N H与前面隔三个氨基酸残基的C O形成的 1 螺旋 沿主链计数 一个氢键闭合的环包括13个原子 故 螺旋也称为3 613螺旋 1 螺旋 肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧 其形状 大小及电荷影响 螺旋的形成 链中如有脯氨酸 则螺旋被中断 产生一个 结节 脯氨酸 1 螺旋 甘氨酸由于没有侧链的约束 难以形成 螺旋所需的二面角 如肽链中连续存在带相同电荷的氨基酸 由于同性电荷相斥也会影响 螺旋不稳定 甘氨酸 影响 螺旋稳定的因素有 极大的侧链基团 存在空间位阻 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基 同种电荷的互斥效应 有Pro等亚氨基酸存在 不能形成氢键 2 折叠 折叠是天然蛋白质中另一种基本结构组件 又称 片层是L Pauling和R B Corey继发现 螺旋结构后在同年发现的另一种蛋白质二级结构 折叠结构是由两条肽链或一条肽链内的各肽段之间的C O与NH H形成氢键而构成的 它是一种肽链相当伸展的重复性结构可分为平行式和反平行式两种类型 2 折叠 平行式 反平行式 所有肽链的N 端都在同一边 相邻两条肽链的方向相反 2 折叠 2 折叠 其结构要点如下 肽主链处于最伸展的构象 主要作用力氢键 碳原子位于折叠线上 连续的酰胺平面排列成折叠形式 在折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面 并交替地从平面上下两侧伸出 反平行折叠片比平行折叠片更稳定 2 折叠 主要是由两条肽链形成的也可以在同一肽链的不同部分之间形成 氢键 3 转角 蛋白质分子中 肽链经常会出现180 的回折 在这种回折角处的构象就是 转角 也被称为 弯曲 回折和发夹结构 转角使肽链走向改变 一般含有2 16个氨基酸残基 3 转角 主要结构特点有 转角中 第一个氨基酸残基的 C O 与第四个残基的 NH 形成氢键 转角的特定构象在一定程度上取决于它的氨基酸组成 3 转角 转角 4 无规则卷曲 无规则卷曲又称为自由回转 指没有特定规律的松散肽链结构肽的这种构象可能对蛋白质多变的立体结构与复杂功能具有贡献 已经鉴定到某些蛋白质中仅有这种结构 称为固有的无结构蛋白质 1 蛋白质分子的二级结构 螺旋 折叠片 转角 无规卷曲 2 蛋白质分子的三级结构 蛋白质三级结构是指上述蛋白质的 螺旋 折叠以及 转角等二级结构受侧链和各主链构象单元间的相互作用 从而进一步卷曲 折叠成具有一定规律性的三维空间结构 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置 蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键 包括疏水作用 氢键 盐键 范德华力等 还有二硫键等 其中疏水作用是主要作用力 2 蛋白质分子的三级结构 磷酸丙糖异构酶的三级结构 2 蛋白质分子的三级结构 肌球蛋白的部分三级结构 2 蛋白质分子的三级结构 在蛋白质二级结构与三级结构之间 还有一些过渡结构层次 主要是超二级结构和结构域在许多蛋白质分子中 可发现二个或三个具有二级结构的肽段 在空间上相互接近 形成一个有规则的二级结构组合 被称为超二级结构 超二级结构有 螺旋 环 螺旋 折叠 螺旋 折叠 发夹 希腊钥匙等多种组合类型 2 蛋白质分子的三级结构 常见的超二级结构 2 蛋白质分子的三级结构 结构域是主要存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立的 在空间上可以明显区分的三级折叠实体 一个分子中的结构域区间以共价键相连 免疫球蛋白的一个结构域 丙酮酸激酶的一个结构域 2 蛋白质分子的三级结构 结构域通常是几个超二级结构的组合 对于较小的蛋白质分子 结构域与三级结构等同 即这些蛋白为单结构域 结构域一般由100 200个氨基酸残基组成 但大小范围可达40 400个残基 氨基酸可以是连续的 也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙 比较松散 往往是蛋白质优先被水解的部位 酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由 铰链区 相连 使分子构象有一定的柔性 通过结构域之间的相对运动 使蛋白质分子实现一定的生物功能 在蛋白质分子内 结构域可作为结构单位进行相对独立的运动 水解出来后仍能维持稳定的结构 甚至保留某些生物活性 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 螺旋 转角 折叠 二硫键 结构域1 结构域2 结构域 domain 也可理解成大分子蛋白质的三级结构被分割成一个或数个球状或纤维状的区域 折叠得较为紧密 各行使其功能 2 蛋白质分子的三级结构 免疫球蛋白的一个结构域 丙酮酸激酶的一个结构域 2 蛋白质分子的三级结构 维持三级结构的作用力 2 蛋白质分子的三级结构 维持三级结构的作用力 亚基之间的结合主要是氢键和离子键 还有疏水作用力 范德华力 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用 称为蛋白质的四级结构 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链 每一条多肽链都有完整的三级结构 称为蛋白质的亚基 subunit 3 蛋白质分子的四级结构 3 蛋白质分子的四级结构 蛋白质可据四级结构分为单体蛋白质 二聚体 三聚体 寡聚体和多聚体寡聚蛋白质可以由单一类型的亚基组成 称为同聚蛋白质 也可以由几种不同类型的亚基组成 称为杂聚蛋白质亚基通常由一条多肽链组成 有时含两条以上的多肽链 单独存在时一般没有生物活性 3 蛋白质分子的四级结构 血红蛋白A 烟草斑纹病毒的外壳蛋白 3 蛋白质分子的四级结构 3 蛋白质分子的四级结构 血红蛋白中的二聚体之一 2与 2 血红蛋白的一 二 三 四级结构 一级结构 相邻AA间的共价结合二级结构 短距离AA之间的非共价连接三级结构 远距离AA之间的非共价连接四级结构 多肽链之间的非共价连接P52 蛋白质分子中的共价键与次级键 二 三 四级结构 共价键 次级键 化学键 肽键 一级结构 氢键 二硫键 疏水键 盐键 范德华力 三 四级结构 四 蛋白质结构与功能的关系 1 蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础2 蛋白质的功能依赖特定空间结构 一 一级结构是空间构象的基础 1 蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 二 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能 三 氨基酸序列提供重要的生物化学信息 一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素 cytochromeC 比较它们的一级结构 可以帮助了解物种进化间的关系 四 重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病 例 镰刀形红细胞贫血 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病 称为 分子病 A 正常的血细胞 血红蛋白肽链中的第六个氨基酸是谷氨酸 B 镰形细胞 其血红蛋白的第六个氨基酸是缬氨酸 正常红细胞 左 与镰刀形红细胞 右 肌红蛋白 血红蛋白含有血红素辅基 血红素结构 2 蛋白质的功能依赖特定空间结构 一 血红蛋白亚基与肌红蛋白的构象相似 肌红蛋白 myoglobin Mb 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质 有8段 螺旋结构 血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连 加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2 形成配位结合 所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合 血红蛋白 hemoglobin Hb 血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构 每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧 Hb亚基之间通过8对盐键 使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合 Hb与O2结合后称为氧合Hb 氧合Hb占总Hb的百分数 称百分饱和度 随O2浓度变化而改变 二 血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合 肌红蛋白 Mb 和血红蛋白 Hb 的氧解离曲线 协同效应 cooperativity 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象 称为协同效应 如果是促进作用则称为正协同效应 positivecooperativity 如果是抑制作用则称为负协同效应 negativecooperativity 变构效应 allostericeffect 一些效应剂可与某些蛋白质分子特定部位可逆地结合 而使其构象改变 从而改变生物活性 称变构效应 第五节蛋白质一级结构的研究方法 1 蛋白质样品预处理2 测定氨基酸的组成3 蛋白质的N 末端和C 末端的测定4 专一性的部分裂解5 肽片段的分离纯化6 肽段氨基酸顺序的测定7 确定整个肽链的氨基酸序列 1 蛋白质样品预处理 纯化已知相对分子质量打开二硫键和非共价键 含巯基乙醇的高浓度尿素溶液 2 测定氨基酸的组成 确定蛋白质所含氨基酸的种类 并明确每种氨基酸有多少 目前较为成功的是将蛋白质经6mol LHCl在110 下水解24h后 用氨基酸自动分析仪进行测定 3 蛋白质的N 末端和C 末端的测定 1 N 末端测定方法 2 C 末端分析方法 1 N 末端测定方法 Sanger法 2 4 二硝基氟苯在碱性条件下 能够与肽链N 端的游离氨基作用 生成二硝基苯衍生物 DNP 在酸性条件下水解 得到黄色DNP 氨基酸 该产物能够用乙醚抽提分离 不同的DNP 氨基酸可以用色谱法进行鉴定 2 4 二硝基氟苯法 1 N 末端测定方法 氰酸盐法 异硫氰酸苯酯 此法最大优点是除去N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的 因此 可以用来一步步地测定多肽链N末端的氨基酸顺序 氨基酸分析仪就是根据此原理制成的 2 C 末端分析方法 多肽与肼在无水条件下加热 C 端氨基酸即从肽链上解离出来 其余的氨基酸则变成肼化物 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C 端氨基酸分离 肼解法 2 C 末端分析方法 羧肽酶水解法 能从多肽链的C 端逐个的水解 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量 从而知道蛋白质的C 末端残基顺序 目前常用的羧肽酶有四种 A B C和Y A和B来自胰脏 C来自柑桔叶 Y来自面包酵母 羧肽酶A能水解除Pro Arg和Lys以外的所有C 末端氨基酸残基 B只能水解Arg和Lys为C 末端残基的肽键 但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放 结果不好分析 2 C 末端分析方法 羧肽酶水解法 4 专一性部分裂解 化学法溴化氰法专一性断裂Met羧基形成的肽键 将Met变为高丝氨酸内酯 4 肽链的部分水解和肽段的分离 有较强专一性 水解产率也较高 常用的酶有胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等 酶解法 5 肽片段的分离纯化 处理后得到的肽段 主要通过电泳或高效液相层析分离纯化 得到两套或几套肽片段 6 肽段氨基酸顺序的测定 Edman降解法或序列仪 7 确定整个肽链氨基酸序列 用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序进行比较 根据它们彼此有重叠的部分 确定每个肽段的适当位置 拼凑出整个肽链的氨基酸顺序 7 确定整个肽链氨基酸序列 第五节蛋白质的理化性质 一 蛋白质的酸碱性质二 蛋白质的胶体性质三 蛋白质的沉淀反应四 蛋白质的变性和复性五 蛋白质的颜色反应 一 蛋白质的酸碱性质 C O O Pr H 3 N C O O Pr H 2 N pH pI pH pI pH pI 由于蛋白质是由氨基酸组成 氨基酸所具有的两性性质 蛋白质也同样具有 一 蛋白质的酸碱性质 当蛋白质溶液处于某一pH值时 酸性基团带的负电荷恰好等于碱性基团带的正电荷 蛋白质分子净电荷为零 在电场中 既不向阳极移动 也不向阴极移动 这个pH值称为蛋白质的等电点 用pI来表示 二 蛋白质的胶体性质 分散相质点小于1nm时称为真溶液 分散相质点大于100nm时称为悬浊液 而分散相质点在1 100nm之间时称为胶体溶液 蛋白质在水溶液中的颗粒约为1 100nm 所以蛋白质溶液属于胶体系统 是一种亲水胶体 蛋白质分子颗粒是分散相 水是分散介质 蛋白质溶液也具有布朗运动 丁达尔效应以及不能透过半透膜等性质 二 蛋白质的胶体性质 利用蛋白质不能透过半透膜的性质 常将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中 置于流水中逐渐将小分子杂质除去 起到纯化的目的 这种方法即为透析 二 蛋白质的胶体性质 透析 二 蛋白质的胶体性质 形成水化层形成双电层 为什么蛋白质具有胶体性质 三 蛋白质的沉淀反应 1 盐析和盐溶法2 有机溶剂沉淀法3 重金属盐沉淀法4 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质5 加热凝固 1 盐析和盐溶法 等电点时 无电荷间的相互作用 聚合沉淀 加入少量盐离子后破坏了这