分子生物学课件07.ppt

第七章基因的表达与调控 真核基因表达调控模式 本章所讲述内容 1 真核生物的基因结构与转录活性 2 真核基因的转录水平调控 3 反式作用因子的调控作用 4 真核基因转录调控的主要模式 5 其他水平的基因调控 本节课所讲述内容 真核生物的基因结构与转录活性 1 简述真核生物基因表达调控总论 2 真核基因组的一般构造特点 3 基因的典型结构及特点 4 真核生物DNA水平上的基因表达调控 5 DNA甲基化与基因活性的调控 基因表达是基因经过转录 翻译 产生有生物活性的蛋白质的整个过程 转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节 真核基因表达调控的位点多 转录在细胞核 线粒体基因的转录在线粒体内 翻译在胞浆 分开的 因此其调控增加了环节和复杂性 转录后的调控占有了更多的分量 真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所决定基因表达调控上的巨大差别 原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件 或使细胞在受到损伤时 尽快得到修复 所以 原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的 真核生物 除酵母 藻类和原生动物等单细胞类之外 主要由多细胞组成 每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物 人类细胞单倍体基因组就包含有3 109bp总DNA 约为大肠杆菌总DNA的1000倍 是噬菌体总DNA的10万倍左右 真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因 从而实现 预定 的 有序的 不可逆转的分化 发育过程 并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能 真核生物基因调控 根据其性质可分为两大类 第一类是瞬时调控或称可逆性调控 它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应 包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节 第二类是发育调控或称不可逆调控 是真核基因调控的精髓部分 它决定了真核细胞生长 分化 发育的全部进程 在真核生物中基因表达的调节其特点是 1 多层次 2 无操纵子和衰减子 3 个体发育复杂 4 受环境影响较小 基因表达的多级调控基因的结构活化 转录起始 转录后加工及转运 mRNA降解 翻译及翻译后加工及蛋白质降解等均为基因表达调控的控制点 可见 基因表达调控是在多级水平上进行的复杂事件 其中转录起始是基因表达的基本控制点 研究基因调控主要应回答3个问题 什么是诱发基因转录的信号 基因调控主要是在哪一步 模板DNA的转录 mRNA的成熟或蛋白质合成 实现的 不同水平基因调控的分子机制是什么 真核基因组的一般构造特点 在真核细胞中 一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链 不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式 真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合 只有一小部分DNA是裸露的 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的 大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排 还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数 在真核生物中 基因转录的调节区相对较大 它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对 这些调节区一般通过改变整个所控制基因5 上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力 在原核生物中 转录的调节区都很小 大都位于启动子上游不远处 调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合 真核生物的RNA在细胞核中合成 只有经转运穿过核膜 到达细胞质后 才能被翻译成蛋白质 原核生物中不存在这样严格的空间间隔 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程 maturationandsplicing 才能顺利地翻译成蛋白质 7 1 1基因的典型结构及特点 1 染色体结构复杂由DNA 组蛋白 非组蛋白等大分子组成 其基本结构物质是DNA和组蛋白 核小体是染色质的基本单位 真核染色体上三要素 DNA复制起始点 着丝点 centromere 和端粒 telomere 目前通用的酵母人工染色体 YAC 以及正在研制的哺乳动物细胞人工染色体 MAC 就是以此为基础 再加自主复制序列 ARS 选择标记和插入位点组建的 2 DNA顺序重复 轻度 中度 高度重复序列三种 轻度重复序列 单拷贝基因 一个基因组中有一个或几个拷贝的序列 例如结构基因基本上属于不重复序列 如蛋清蛋白 蚕的丝心蛋白等 中度重复序列 l0个至几百个拷贝的序列 各种rRNA tRNA及某些结构蛋白基因 如组蛋白基因 高度重复序列 从几百到几百万个 通常说的卫星DNA就属于高度重复序列 重复序列的存在是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征 3 基因不连续性 interruptedgene 基因的编码序列在DNA分子上是不连续的 为不编码的序列所隔开 不连续基因是通过mRNA和DNA杂交试验发现的 外显子 exon 编码序列内含子 intron 非编码序列外显子和内含子的概念与是否编码氨基酸的概念并不相对应 从不连续基因到成熟mRNA之间存在着一个基因转录的中间体 叫做初级转录物 叫做不均一核RNA heterogeneousnuclearRNA hnRNA 这个基因的初级转录物既含有外显子又含有内合子序列 从不均一核RNA到成熟mRNA要经过一转录后的加工拼接过程 真核生物基因的不连续性和转录后加工是真核基因有别于原核基因的又一重要特征 在真核生物中也有些基因是不含内含子的 如组蛋白基因及 型 型干扰素基因 大多数酵母蛋白基因等 在一个结构基因中 编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起 而常常被长度不等的内含子所隔离 形成镶嵌排列的断裂方式 所以 真核基因有时被称为断裂基因 interruptedgene 目前尚不清楚内含子的生理功能 研究发现 只有真核生物具有切除基因中内含子 产生功能型mRNA和蛋白质的能力 原核生物一般不具有这种本领 如果要在原核细胞里表达真核基因 必须首先构建切除内含子的重组基因 才有可能得到所研究的蛋白质 4 存在许多基因家族 genefamily 来源相同 结构相似 功能相关的基因组成为单一的基因簇或称基因家族 同一家族中的成员有时紧密地排列在一起 成为一个基因簇 更多的时候 它们却分散在同一染色体的不同部位 甚至位于不同的染色体上 具有各自不同的表达调控模式 简单多基因家族 简单多基因家族中的基因一般以串联方式前后相连 在大肠杆菌中 16S 23S和5SrRNA基因联合成一个转录单位 各种rRNA分子都是从这个转录单位上剪切下来的 在真核生物中 前rRNA转录产物的分子量为45S 包括18S 28S和5 8S三个主要rRNA分子 前rRNA分子中至少有100处被甲基化 主要是核糖的2 OH甲基化 原始转录产物也被特异性RNA酶切割降解 产生成熟rRNA分子 5SrRNA作为一个独立的转录单位 由RNA聚合酶III 而不是聚合酶I 完成转录 复杂多基因家族 复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成 基因家族之间由间隔序列隔开 并作为独立的转录单位 现已发现存在不同形式的复杂多基因家族 海胆的组蛋白基因家族串联单位中的每一个基因分别被转录成单顺反子RNA 这些RNA都没有内含子 而且各基因在同一条DNA链上按同一方向转录 每个基因的转录与翻译速度都受到调节 研究还表明 在一个特定的细胞中 并不是所有串联的单位都得到转录 胚胎发育的不同阶段或不同组织中 有不同的串联单位被转录 暗示可能存在具有不同专一性的组蛋白亚类和发育调控机制 5 存在串联重复基因 其特点是各成员之间有高度的序列一致性甚至完全相同 拷贝数高 非转录的间隔区短而一致 组蛋白基因 rRNA基因 tRNA基因都是串联重复基因 这些基因的产物在细胞中都是大量需要的 顺式作用元件 是指那些与结构基因表达调控相关 能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列 包括启动子 上游启动子元件 增强子 加尾信号和一些反应元件等 反式作用因子 是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子 增强子 位于真核基因中远离转录起始点 能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列 它可位于被增强的转录基因的上游或下游 也可相距靶基因较远 7 1 3真核生物DNA水平上的基因表达调控 分子生物学的最新研究表明 在个体发育过程中 用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化 从而控制基因表达和生物体的发育 高度重复基因的形成通常与个体分化阶段DNA的某些变化有关 例如 一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA 而其前体细胞却不产生珠蛋白 许多情况下 这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化 这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式 它包括了基因丢失 扩增 重排和移位等方式 通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性 这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的 因为它使基因组发生了改变 7 1 3 1 开放 型活性染色质 activechromatin 结构对转录的影响 真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的 转录发生之前 染色质常常会在特定的区域被解旋松弛 形成自由DNA 这种变化可能包括核小体结构的消除或改变 DNA本身局部结构的变化等 这些变化可导致结构基因暴露 促进转录因子与启动区DNA的结合 诱发基因转录 用DNA酶I处理各种组织的染色质时 发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的DNA更容易被DNA酶I所降解 鸡成红细胞 erythroblast 染色质中 血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解 鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵清蛋白基因 而不是 血红蛋白基因 存在于 灯刷型 染色体 lampbrush 上的环形结构可能与基因的活性转录有关 灯刷型 染色体只有在两栖类动物卵细胞发生减数分裂时才能被观察到 它是染色体充分伸展时的一种形态 高倍电镜下观察发现 灯刷型染色体上存在许多突起的 泡 状或 环 状结构 有时还能看到RNP沿着这些突起结构移动 表明这些DNA正在被RNA聚合酶所转录 1 基因的扩增 amplification 两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18SrRNA和28SrRNA的DNA 在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍 一旦卵母细胞成熟 多余的rDNA就没有用了 将被逐渐降解 受精之后 染色体DNA开始复制 并通过有丝分裂的方式 不断扩大细胞群体 在此期间 多余的rDNA继续被降解 直到分裂产生几百个细胞时 rDNA的过剩现象就不复存在了 7 1 3 2 基因扩增 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象 它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要 是基因活性调控的一种方式 7 1 3 3 基因重排 将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录 这种方式被称为基因重排 真核生物最典型的例子是免疫球蛋白在成熟过程中的重排以及酵母的交配型转变 通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T 细胞受体基因的表达 前者是由B淋巴细胞合成的 而后者则由T 淋巴细胞合成 抗体有100万种以上 一种淋巴细胞只产生一种抗体 免疫球蛋白的肽链主要由可变区 V区 恒定区 C区 以及两者之间的连接区 J区 组成 V C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远 编码产生免疫球蛋白的细胞发育分化时 通过染色体内DNA重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起 从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因 本节课所讲述内容 真核生物的基因结构与转录活性 1 真核基因表达调控的最显著特征是什么 2 真核生物基因调控根据其性质可分为哪两大类 3 真核生物中基因表达的调节特点是什么 4 相对于原核生物 真核基因组的一般构造特点是什么 5 基因的典型结构及特点 6 真核生物DNA水平上的基因表达调控 掌握几个概念 开放性活性染色体对基因转录的影响 基因扩增 基因重排 真核基因的转录水平调控 本节课所讲述内容 1 真核生物的基因结构与转录活性 DNA甲基化与基因活性的调控 2 真核基因的转录 3 反式作用因子 7 1 4DNA甲基化与基因活性的调控 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一 这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关 大量研究表明 DNA甲基化能关闭某些基因的活性 去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达 DNA甲基化能引起染色质结构 DNA构象 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变 从而控制基因表达 研究证实 CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1 3以上由于碱基转换而引起的遗传病 DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中 实验证明 这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关 还通过改变基因的表达参与细胞的生长 发育过程及染色体印迹 X染色体失活等的调控 7 1 4 1 DNA的甲基化 DNA甲基化主要形成5 甲基胞嘧啶 5 mC 和少量的N6 甲基腺嘌呤 N6 mA 及7 甲基鸟嘌呤 7 mG 在真核生物中 5 甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列 CpXpG CCA TGG和GATC中 因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的 极易自发脱氨 生成胸腺嘧啶 由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上 这段序列往往被称为CpG岛 真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性 一种被称为日常型甲基转移酶 另一种是从头合成型甲基转移酶 前者主要在甲基化母链 模板链 指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化 该酶催化特异性极强 对半甲基化的DNA有较高的亲和力 使新生的半甲基化DNA迅速甲基化 从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变 后者催化未甲基化的CpG成为mCpG 它不需要母链指导 但速度很慢 7 1 4 2 DNA甲基化抑制基因转录的机理 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化 从而影响了蛋白质与DNA的相互作用 抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率 研究表明 当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时 DNA的构型存在着很大的差别 甲基化达到一定程度时会发生从常规的B DNA向Z DNA的过渡 由于Z DNA结构收缩 螺旋加深 使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始 有实验用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料 比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性 发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合 降低了其体外转录活性 5 甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的 基因的5 端和3 端往往富含甲基化位点 而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关 对于弱启动子来说 稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性 当这一类启动子被增强时 带有增强子 即使不去甲基化也可以恢复其转录活性 若进一步提高甲基化密度 即使增强后的启动子仍无转录活性 因为甲基化对转录的抑制强度与MeCPl methylCpG bindingproteinl 结合DNA的能力成正相关 甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性 7 1 4 3 DNA甲基化与X染色体失活 X染色体失活是发育过程中独特的调节机制 雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活 以确保与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同 一旦发生X染色体失活 这个信息便能够稳定地传递给子代细胞 使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活 7 2真核基因的转录 顺式元件 1 核心启动子成分 如TATA框 2 上游启动子成分 如CAAT框 GC框 3 远上游顺序 如增强子 酵母的UAS upstreamactivatorsequences 等 4 特殊细胞中的启动子成分 如淋巴细胞中的Oct octamer 和 B 真核基因调控主要也是在转录水平上进行的 受大量特定的顺式作用元件 cis actingelement 又称顺式作用元件 和反式作用因子 trans actingfactor 又称跨域作用因子 的调控 真核生物的转录调控大多数是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的 一个完整的基因 不但包括编码区 codingregion 还包括5 和3 端长度不等的特异性序列 它们虽然不编码氨基酸 却在基因表达的过程中起着重要作用 所以 基因 的分子生物学定义是 产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列 增强子及其对转录的影响 增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列 作为基因表达的重要调节元件 增强子通常具有下列性质 1 增强效应十分明显 一般能使基因转录频率增加10 200倍 2 增强效应与其位置和取向无关 不论增强子以什么方向排列 5 3 或3 5 甚至和基因相距3kb 或在基因下游 均表现出增强效应 3 大多为重复序列 一般长约50bp 适合与某些蛋白因子结合 其内部常含有一个核心序列 G TGGA TA TA T G 是产生增强效应时所必需的 4 增强效应有严密的组织和细胞特异性 说明只有特定的蛋白质 转录因子 参与才能发挥其功能 5 没有基因专一性 可以在不同的基因组合上表现增强效应 6 许多增强子还受外部信号的调控 如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子 就可以对环境中的锌 镉浓度做出反应 Enhancer Gene 5 3 directionoftranscription Enhancer Enhancer 增强子可能有如下3种作用机制 影响模板附近的DNA双螺旋结构 导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下 以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间 成环 连接 活化基因转录 将模板固定在细胞核内特定位置 如连接在核基质上 有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力 促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动 增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的 入口 增强子的作用原理是什么呢 增强子的功能是可以累加的 SV40增强子序列可以被分为两半 每一半序列本身作为增强子功能很弱 但合在一起 即使其中间插入一些别的序列 仍然是一个有效的增强子 因此 要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变 对SV40增强子而言 没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍 真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的 由于它们常与特定的功能基因连锁在一起 因此被称为顺式作用元件 这些序列组成基因转录的调控区 影响基因的表达 在转录调控过程中 除了需要调控区外 还需要反式作用因子 一般认为 如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的 它就是转录复合物的一部分 根据各个蛋白成分在转录中的作用 能将整个复合物分为3部分 反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上 参与调控靶基因转录效率的蛋白质 参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基 不具有基因特异性 与转录的起始或终止有关的辅助因子 不具有基因特异性 与特异调控序列结合的转录因子 它们中有些被认为是转录复合物的一部分 因为所有或大部分基因的启动区都含有这一特异序列 更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白 它们是起始某个 类 基因转录所必需的 7 3反式作用因子 反式作用因子可以分为3类 1 通用反式作用因子 主要识别启动子的核心启动成分 如TBP 2 特殊组织与细胞中的反式作用因子 如淋巴细胞中的Oct 2 3 和反应性元件 responseelenents 相结合的反式作用因子 如HSE 热休克反应元件 heatshockresponseelement GRE 糖皮质激素反应元件glucocorticoidresponseelement MRE 金属反应元件 metalresponseelement TRE 肿瘤诱导剂反应元件 tumorgenicagentresponseelement 一 蛋白质直接和DNA结合 1 螺旋转角螺旋 Helix turn helix HTH 最初在 噬菌体的阻遏蛋白中发现的一种DNA结合结构域 在阻遏蛋白氨基端有5段 螺旋 每段螺旋之间折转成一定角度相连接 其中两段负责同DNA结合 螺旋3由9个氨基酸组成 与前面的由7个氨基酸组成的 螺旋2形成一个角度 螺旋3通过氨基酸侧链同DNA碱基之间的氢键同DNA序列相结合 所以 螺旋 被称为识别螺旋 recognitionhelix 螺旋2则是通过氢键同DNA的磷酸骨架相接触 这种相互作用对于同DNA结合是必需的 但并不控制对靶序列识别的专一性 2 锌指结构 zincfimger 是一个蛋白质结构域 由重复的半胱氨酸和组氨酸或重复的半胱氨酸在一个金属锌离子四周形成一个四面体的排列 长约30个aa 其中4个氨基酸 Cys或2个Cys 两个His 与一个Zinc原子相结合 与Zinc结合后锌指结构较稳定 最初是在爪蟾 Xenopuslaevis 的RNA聚合酶III转录因子 TFIIIA 中发现的 9个串联重复的锌指区组成 每个单位大约由30个氨基酸残基组成 基序因在锌结合位点上突出的氨基酸环的形状如同手指 所以称为 指状 结构 这种蛋白质结构域是同DNA或RNA结合的部位 单个的锌指保守序列是 Cys X2 4 Cys X3 Phe X5 Leu X2 His X2 His这里x2 x5代表2个和5个任何一种氨基酸残基 根据锌指结构中与锌配位的半胱氨酸 C 和组氨酸 H 的数目和位置 可将指状结构分为2类 型 2Cys 2His TFIIIA SP1 型 2cys 2cys GAL4 亲脂性 amphipathic 的 螺旋 包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸 两条多肽链以此形成二聚体 每隔6个残基出现一个亮氨酸 由赖氨酸 Lys 和精氨酸 Arg 组成DNA结合区 Leucineziipper 同二聚体 honwdimers 异二聚体 hefercdimers C Jun C Fos Myc 3 亮氨酸拉链 亮氨酸是疏水性氨基酸 排列在双螺旋的一侧 所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧 当2个蛋白质分子平行排列时 亮氨酸之间相互作用形成二聚体 形成 拉链 由于这类蛋白质都以二聚体形式与DNA结合 两个蛋白质 螺旋上的亮氨酸一侧是形成拉链型二聚体的基础 然而 亮氨酸拉链区并不能直接结合DNA 只有肽链氨基端20 30个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合 在 拉链 式的蛋白质分子中 亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同DNA结合 不形成二聚体 该碱性区对DNA的亲和力明显降低 所以 这类蛋白质的DNA结合结构域实际是以碱性区和亮氨酸拉链结构域整体作为基础的 该调控区长约50个aa残基 同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能 其主要特点是可形成两个亲脂性 螺旋 两个螺旋之间由环状结构相连 其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的 在HLH中带有碱性区的肽链称为碱性HLH bHLH protein bHLH又分为两类 A类是可以广泛表达的蛋白 包括哺乳动物的E12 E47 可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合 和果蝇da daughterless 性别控制的总开关基因 的产物 B类是组织特异性表达的蛋白 包括哺乳动物的MyoD 肌浆蛋白 myogen 基因的转录因子果蝇的AC S achaete scute无刚毛基因的产物 4 螺旋一环一螺旋 HLH DNA结合蛋白的共同特性 1 具有一些与DNA结合的螺旋区 2 能形成二聚体 3 有一个共同的基序 基序由40 50个氨基酸组成 含有2个两亲的 amphipathic 既有极性基也有非极性基 螺旋 由2个长度不等的连接区 环 相连 通过两条螺旋对应位置上的疏水性氨基酸残基之间的相互作用 可以生成同源二聚体或异源二聚体 每个螺旋区长15一16个氨基酸 其中有几个氨基酸残基是保守的 两个螺旋区之间的环使两个螺旋区可以彼此独立地相互作用 复习上节课所讲述内容 1 DNA甲基化抑制转录的机理 2 DNA甲基化与X染色体失活 3 增强子通常具有下列性质 4 反式作用因子的概念 5 转录激活蛋白结构域与DNA结合的几种形式 6 结论 真核生物的转录调控大多数是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的 本节课所讲述内容 1 蛋白质磷酸化 信号转导及基因表达 2 激素及其影响 3 热激蛋白诱导的基因表达 4 金属硫蛋白基因的多重调控 7 4 1蛋白质磷酸化 信号转导及基因表达 蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式 几乎涉及所有的生理及病理过程 如糖代谢 光合作用 细胞的生长发育 神经递质的合成与释放甚至癌变等等 蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上 位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程 其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的 称为蛋白质脱磷酸化 蛋白质的磷酸化反应是生物体内存在的一种普遍的调节方式 在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位 已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因 细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合 能诱导受体蛋白构象变化 使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内 或使受体发生寡聚化而被激活 一般情况下 受体分子活化细胞功能的途径有两条 一是受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性 胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递 二是配体与细胞表面受体结合 通过G蛋白介异的效应系统产生介质 活化丝氨酸 苏氨酸或酪氨酸激酶 从而传递信号 1 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用 1 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点 与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使 如cAMP Ca2 DG 二酰甘油 diacylglycerol 等 这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响 2 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶 活性 与酶的重新合成及分解相比 这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应 3 对外界信号具有级联放大作用 4 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应 被磷酸化的主要氨基酸残基 丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸 组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化 2 真核细胞主要跨膜信号转导途径 3 蛋白激酶的种类与功能 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类 第一类为丝氨酸 苏氨酸型 这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化 第二类为酪氨酸型 被磷酸化的是底物的酪氨酸残基 第三类是 双重底物特异性蛋白激酶 dual specificityproteinkinase 既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化 细胞受刺激以后 通过蛋白质磷酸化及一系列级联放大过程将胞外信号转化为细胞内信号 从而引起广泛的生理反应 根据是否有调节物来分又可分成两大类 信使依赖性蛋白质激酶 messenger dependentproteinkinase 包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素 生长因子 依赖性激酶两个亚类 非信使依赖型蛋白激酶 4 受cAMP调控的A激酶 被A激酶磷酸化的蛋白质其N端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸 特异氨基酸的磷酸化 X Arg Arg X Ser X 改变了这一蛋白的酶活性 这一酶活性代表了绝大多数细胞中cAMP所引起的全部反应 PKA全酶由4个亚基组成 R2C2 包括两个相同的调节亚基 R 和两个相同的催化亚基 C 全酶的分子量为150 170kD C亚基具有催化活性 R亚基具有调节功能 有两个cAMP结合位点 R亚基对C亚基具有抑制作用 所以 R和C聚合后的全酶 R2C2 无催化活性 R亚基与cAMP的结合导致C亚基解离并表现出催化活性 激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合 诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶 再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶 活化糖原磷酸化酶 最终将糖原磷酸化 进入糖酵解并提供ATP 5 C激酶与PIP2 IP3和DAG 磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇 4 5 二磷酸 PIP2 的两个酶解产物 肌醇1 4 5 三磷酸 IP3 和二酰基甘油 DAG C激酶 PKC 是依赖于Ca2 的蛋白质激酶 由于IP3所引起的细胞质Ca2 浓度升高 导致C激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处 并被DAG和Ca2 的双重影响所激活 C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响 原因是后者大大提高了C激酶对于Ca2 的亲和力 从而使得C激酶能被生理水平的Ca2 离子所活化 C激酶主要实施对丝氨酸 苏氨酸的磷酸化 它具有一个催化结构域和一个调节结域 6 CaM激酶及MAP激酶 Ca2 的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶 CaM kinase 来实现 它们也是一类丝氨酸 苏氨酸激酶 但仅应答于细胞内Ca2 水平 MAP激酶 mitogen activatedproteinkinase MAP kinase 又称为extracellular signal regulatedkinase ERKS 活性受许多外源细胞生长 分化因子的诱导 也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受体系统的调控 MAP 激酶的活性取决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸 丝氨酸残基是否都被磷酸化 科学家把能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为MAP 激酶 激酶 它的反应底物是MAP激酶 MAP 激酶 激酶本身能被MAP 激酶 激酶 激酶所磷酸化激活 后者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活 从而在信息传导中发挥功能 7 酪氨酸蛋白激酶 对于许多生长因子受体的研究表明 跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用 表皮生长因子 EGF 胰岛素样生长因子 IGF 成纤维细胞生长因子 FGF 神经生长因子 NGF 血小板衍生生长因子 PDGF 和血管内皮细胞生长因子 VEGF 受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区 具有受体功能的酪氨酸蛋白激酶 receptorproteintyrosinekinase RPTK 包括三个结构域 胞外的配体结合区 细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构 8 蛋白质磷酸化与基因表达 处于信号传递链终端的蛋白质磷酸化既能对许多酶蛋白及生理代谢过程起直接的调节作用 又能通过使转录因子磷酸化来调节基因活性 7 4 2激素及其影响 许多类固醇激素 如雌激素 孕激素 醛固酮 糖皮质激素和雄激素 以及一般代谢性激素 如胰岛素 的调控作用都是通过启始基因转录而实现的 靶细胞具有专一的细胞质受体 可与激素形成复合物 导致三维结构甚至化学性质的变化 经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内 并与染色质的特定区域相结合 导致基因转录的起始或关闭 研究发现 体内存在的许多糖皮质类激素应答基因都有一段大约20bp的顺式作用元件 激素应答元件 简称HRE 该序列具有类似增强子的作用 其活性受激素制约 靶细胞中含有大量激素受体蛋白 而非靶细胞中没有或很少有这类受体 这是激素调节转录组织特异性的根本原因 所有固醇类激素的受体蛋白分子都有相同的结构框架 包括保守性极高的 位于分子中央的DNA结合区 位于C端的有较强同源性的激素结合区和保守性较小的N端 该区的具体功能不详 但它的存在保证了转录的高效进行 研究还发现 如果糖皮质激素受体蛋白激素结合区的某个部分丢失 就变成一种永久型的活性分子 即无需激素诱导也有激活基因转录的作用 科学家认为 激素 受体与顺式作用元件的结合位点三者缺一不可 其中无论是受体蛋白与激素的结合 还是激素本身 都不是与DNA结合并激活转录所必须的 其实 通常情况下 受体蛋白中激素结合结构域妨碍了DNA结合区及转录调控区发挥生理功能 只有与相应激素结合后才能打破这种障碍 激素受体对各自特定的激素具有高度特异的识别能力及亲和力 激素到达靶细胞时能迅速与受体结合生成激素 受体复合物 诱导生理生化效应 1 受体流动假说 当激素与受体结合时 激素 受体复合物可在膜内移动并与腺苷酸环化酶结合 激活环化酶 引发后续效应 2 中介物假说 研究腺苷酸环化酶和胰高血糖素受体发现 受体与酶之间可能通过膜脂耦联在一起 3 邻位互调假说 根据GTP能影响激素与受体结合并进而影响腺苷酸环化酶活性的现象 认为该酶系统至少存在3个活性部位 即激素 受体结合部位 Mg2 ATP作用中心和核苷酸调节部位 激素与其受体的作用假说 7 4 3热激蛋白诱导的基因表达 现代分子生物学上把能与某个 类 专一蛋白因子结合 从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件 responseelement 如热激应答元件 heatshockresponseelement HSE 糖皮质应答元件 glucocorticoidresponseelement GRE 金属应答元件 metalresponseelement MRE 等等 这些应答元件与细胞内专一的转录因子相互作用 协调相关基因的转录 许多生物在最适温度范围以上 能受热诱导合成一系列热休克蛋白 heatshockprotein 受热后 果蝇细胞内Hsp70mRNA水平提高1000倍 就是因为热激因子 heatshockfactor HSF 与hsp70基因TATA区上游60bp处的HSE相结合 诱发转录起始 真核细胞的热休克蛋白可能具有机体保护功能并在细胞的正常生长和发育中起重要作用 HSP70的主要功能是参与蛋白质的代谢 而泛素的的主要功能是清除细胞内的变性蛋白质 HSP还常与具有不同功能的多种蛋白质形成天然复合物 参与有关蛋白质折叠 亚基的组装 细胞内运输以及降解等过程 热休克蛋白参与靶蛋白活性和功能的调节 却不是靶蛋白的组成部分 因此 一般称它为分子伴侣或伴侣蛋白 chaperonine hsp基因中内含子数量都很少 至今为止尚未发现hsp70基因中有内含子 而人hsp90 果蝇hsp82 人hsp27 鸡hsp108和泛素等都只有少量内含子 hsp的这一基本特征保证了它们一旦起始转录不需剪接就可产生出成熟mRNA以适应hsp大量快速表达的需要 防止严重的热休克影响mRNA前体的剪接 7 4 4金属硫蛋白基因的多重调控 金属硫蛋白 metallothionein MT 基因 其5 端调控区有着十分复杂的结构 包含许多调控元件 可以同时受几种转录因子的影响 作为细胞内多余重金属离子的螯合蛋白 这个基因平时就有本底水平的表达 还能受重金属离子 如镉 或糖皮质的诱导而高效表达 该基因5 端调控区除了含有TATA区和GC区外 还有两个序列类似于增强子的本底水平调控元件 basallevelelement BLE 它们共同参与了该基因本底水平的表达 金属离子对该基因转录的诱导是由数个MRE序列介导的 人金属硫蛋白基因5 上游 40 160处含有4个MRE序列 虽然单一MRE序列足以引发重金属离子诱导的基因表达 多个MRE序列被认为有利于该基因大量表达 位于MT基因5 上游 240 260bp处的GRE 是固醇类激素受体的结合位点 删除这个区域不影响基因的本底水平表达和受金属离子诱导的特性 但不再对激素诱导作出反应 与TRE序列一样 GRE也属于增强子范畴 2003年12月8日复习上节课所讲述的主要内容 1 蛋白质磷酸化与去磷酸化 蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上 位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程 其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的 称为蛋白质脱磷酸化 蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式 几乎涉及所有的生理及病理过程 如糖代谢 光合作用 细胞的生长发育 神经递质的合成与释放甚至癌变等等 2 细胞表面的三类受体示意图 3 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应 被磷酸化的主要氨基酸残基 丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸 4 真核细胞主要跨膜信号转导途径 6 蛋白激酶的种类与功能 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类 第一类为丝氨酸 苏氨酸型 这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化 第二类为酪氨酸型 被磷酸化的是底物的酪氨酸残基 第三类是 双重底物特异性蛋白激酶 dual specificityproteinkinase 既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化 细胞受刺激以后 通过蛋白质磷酸化及一系列级联放大过程将胞外信号转化为细胞内信号 从而引起广泛的生理反应 7 根据是否有调节物来分又可将蛋白激酶分成两大类 1 信使依赖性蛋白质激酶 messenger dependentproteinkinase 包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素 生长因子 依赖性激酶两个亚类 2 非信使依赖型蛋白激酶 8 激素及其基因调控 许多类固醇激素 如雌激素 孕激素 醛固酮 糖皮质激素和雄激素 以及一般代谢性激素 如胰岛素 的调控作用都是通过启始基因转录而实现的 靶细胞具有专一的细胞质受体 可与激素形成复合物 导致三维结构甚至化学性质的变化 经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内 并与染色质的特定区域相结合 导致基因转录的起始或关闭 靶细胞中含有大量激素受体蛋白 而非靶细胞中没有或很少有这类受体 这是激素调节转录组织特异性的根本原因 激素受体对各自特定的激素具有高度特异的识别能力及亲和力 激素到达靶细胞时能迅速与受体结合生成激素 受体复合物 诱导生理生化效应 学习本节课内容 真核生物其他水平上的基因调控 1 RNA的加工成熟 2 翻译水平的调控 7 5其他水平上的基因调控 7 5 1RNA的加工成熟 各种基因的转录产物都是RNA 无论是rRNA tRNA还是mRNA 初级转录产物只有经过加工 才能成为有生物功能的活性分子 7 5 1 1 rRNA和tRNA的加工成熟 rRNA加工有两个内容 一个是分子内的切割 另一个是化学修饰 真核生物的rRNA基因转录时 先产生一个45S的前体rRNA 然后被核酸酶逐渐降解 形成成熟的18S 28S和5 8SrRNA rRNA基因转录主要在细胞核仁内进行 初级转录产物45S前体rRNA很快就会被加工降解 生成不同相对分子质量的成熟rRNA rRNA的化学修饰主要是甲基化 原核生物rRNA主要是碱基甲基化 而真核生物rRNA则主要是核糖甲基化 tRNA基因转录时也可能先生成前体tRNA 然后再进行加工成熟 一般认为 tRNA基因的初级转录产物在进入细胞质后 首先经过核苷的修饰 生成4 5S前体tRNA 再行剪接成为成熟tRNA 4S 7 5 1 2 mRNA的加工成熟 编码蛋白质的基因转录产生mRNA 这类基因产物在转录后要进行一系列的加工变化 才能成为成熟的有生物功能的mRNA 这些加工主要包括在mRNA的5 末端加 帽子 在其3 末端加上多聚 A 进行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修饰等 由于mRNA的这些结构与它作为蛋白质合成模板的功能有密切关系 所以是基因表达的重要调控环节 与rRNA tRNA相同 编码蛋白质的基因转录时首先生成前体pre mRNA 或称核不均一RNA hnRNA 然后再加工剪接为成熟mRNA hnRNA确定是mRNA前体的证据 在真核生物细胞核中发现存在代谢十分活跃 平均相对分子质量为2 107 长度不均一的RNA 而细胞质中mRNA的平均相对分子质量仅为1 5 106 hnRNA很不稳定 半衰期只有5 15min 而真核生物mRNA的半衰期一般都比较长 这说明hnRNA不可能是转录的最终产物 而只能是中间产物 用放射性同位素作脉冲标记证明 75 被标记的RNA是hnRNA 这些标记的RNA大部分位于核内 只有10 进入细胞质 所以认为它们是mRNA的前体 hnRNA占细胞全部RNA的3 说明它一经诞生就立即加工变化 不会长久积累下来 hnRNA3 末端也带有多聚 A 加入dAR 脱氧腺嘌呤核苷 抑制多聚 A 的生物合成 hnRNA和mRNA的合成都受到抑制 7 5 1 3 真核生物基因转录后加工的多样性 真核生物的基因可以按其转录方式分为两大类 即简单转录单位和复杂转录单位 这两种转录方式虽然最终都产生蛋白质 但它们的转录后加工方式是不同的 1 简单转录单位 这类基因只编码产生一个多肽 其原始转录产物有时需要加工 有时则不需要加工 这类基因转录后加工有3种不同形式 第一种简单转录单位 如组蛋白基因 它们没有内含子 因此不存在转录后加工问题 其mRNA3 末端没有多聚 A 但有一个保守的回文序列作为转录终止信号 第二种简单转录单位包括腺病毒蛋白IX 干扰素和许多酵母蛋白质基因 它们没有内含子 所编码的mRNA不需要剪接 但需要加多聚 A 第三种简单转录单位包括 和 珠蛋白基因及许多细胞蛋白基因 这些基因虽然都有内含子 需要进行转录后加工剪接 还要加多聚 A 但它们只产生一个有功能的mRNA 所以仍然是简单转录单位 2 复杂转录单位 含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因 它们除了含有数量不等的内含子以外 其原始转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mRNA Transcript1 Transcript2 利用多个5 端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质 利用多个加多聚 A 位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质 虽无剪接 但有多个转录起始位点或加多聚 A 位点的基因 虽然原始转录产物的蛋白质编码区和3 末端都相同 不同的5 末端却导致了分泌型和胞内型蛋白的产生 其中分泌型蔗糖酶是可调节的 而胞内型则是组成型的 7 5 2翻译水平的调控 一 mRNA运输控制 transportcontrol 是对转录本从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节 二 mRNA翻译的控制三 mRNA的结构和翻译的效率四 翻译的起始调节五 选择性翻译六 反义RNA调控七 翻译的自我调节 1 mRNA的稳定性与基因表达调控 真核生物能否长时间 及时地利用成熟的mRNA分子翻译出蛋白质以供生长 发育的需要 是与mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除密切相关的 原核生物mRNA的半衰期很短 平均大约3分钟 高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均约为3小时 在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定 有的寿命长达几天或十几天 加上强启动子的转录 使一些终端细胞特有的蛋白质合成达到惊人的水平 例2 转运铁蛋白受体 TfR 和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒 这两个mRNA上存在相似的顺式作用元件 称为铁应答元件 ironresponseelement IRE IRE与IRE结合蛋白 IREBP 相互作用控制了这两个mRNA的翻译效率 当细胞缺铁时 IREBP与IRE具有高亲和力 两者的结合有效