酶、细胞和原生质体固定化

第五章酶 细胞 原生质体固定化 游离酶在应用中的不足 稳定性差 高温 强酸 强碱 重金属离子 难于回收和重复利用 一次性使用酶 产物的分离纯化困难 固定化酶 细胞 的由来和发展 1916年 Nelson Griffin 酶不溶于水而具有活性 1948年 Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年 Grubhofer Schleith第一次实现了酶的固定化1960年 千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究1969年 千畑一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL AA的光学分析上1971年 固定化酶名称提出 Immobilizedenzyme 1973年 固定化微生物的应用1976年 固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978年 日本用固定化细胞生产酶1979年 固定化植物细胞和动物细胞开始研究1982年 日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸1986年 郭勇等人固定化原生质研究 固定化酶 固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶 用于固定化的酶 通常是经提取分离纯化后的酶 也可以是含酶菌体或菌体碎片 优点 稳定性增加 可反复使用 利于连续操作 易于和反应产物分离 固定化细胞 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞 为动植物来源的天然产物的工业化生产开辟了新的途径 固定化原生质体 为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方法 第一节酶固定化 一 酶和菌体固定化的方法 吸附法 包埋法 结合法 交联法 热处理法 1 吸附法定义 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法 吸附剂 活性炭 氧化铝 硅藻土 羟磷灰石等 特点 操作简单 条件温和 不会引起酶活性损失 但结合力弱 使用受限制 二 包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法 1 凝胶包埋法 将酶分子包埋在凝胶内部的微孔中 天然凝胶 琼脂凝胶 海藻酸钙凝胶 角叉菜胶 明胶等 合成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 光交联树脂等 注意 不适用于底物和产物分子量大的酶的固定化 2 半透膜包埋法 微囊化法 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小球中 制成固定化酶 半透膜 聚酰胺膜 火棉胶膜等 注意 适用于底物和产物分子量都小的酶固定化 定义 酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键或离子键而固定的方法 1 离子键结合法定义 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 常用载体 不溶于水的离子交换剂 DEAE 纤维素 TEAE 纤维素 DEAE 葡聚糖凝胶 特点 反应条件温和 活力损失少 结合力弱 pH和离子强度等条件改变易影响固定化效果 因此须严格控制pH 离子强度和温度等操作条件 3 结合法 2 共价键结合法定义 通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 特点 稳定性好 反应条件激烈 操作复杂 控制条件苛刻 相对酶活力较低载体 纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 甲壳素与载体结合的酶官能团 氨基 羟基 巯基 咪唑基 羧基和酚基 载体的选择载体直接关系到固定化酶的性质和形成 对载体要求 一般亲水载体优于疏水载体 载体结构疏松 表面积大 有一定的机械强度 带有与酶结合的功能基团 没有或很少有非专一性基团 载体来源容易 便宜 并能反复使用 要使载体与酶形成共价键 必须首先使载体活化 即借助于某种方法 在载体上引进某一活泼基团 然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应 形成共价键 载体活化方法 重氮法 叠氮法 溴化氰法 烷基化法 重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应 生成重氮盐衍生物 使载体引进了活泼的重氮基团 载体活化后 活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应 制得固定化酶 叠氮法 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化 生成含叠氮基团的叠氮化合物 羧甲基纤维素叠氮衍生物中活泼的叠氮基团可与酶分子中的氨基形成肽键 使酶固定化 叠氮基团还可以与酶分子中的羟基 巯基等反应 制成固定化酶 溴化氰法 合有羟基的载体 如纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶等 可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物 活化载体上的亚氨碳酸基团在微碱性的条件下 可与酶分子上的氨基反应 制成固定化酶 烷基化法 含羟基的载体可用三氯 均三嗪等多卤代物进行活化 形成含有卤素基团的活化载体 活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基 巯基 羟基等发生烷基化反应 制备成固定化酶 4 交联法定义 利用双功能试剂 在酶分子间或酶与载体间 或酶与惰性蛋白间进行交联反应 将酶固定化 交联试剂 戊二醛 己二胺 顺丁烯二酸酐 双偶氮苯等 戊二醛的两个醛基都可与酶的游离氨基反应 形成席夫碱 使酶交联制成固定化酶 特点 结合牢固 可长时间使用 交联反应条件激烈 酶活力损失大 常将交联法与吸附法或包埋法联合使用 双重固定化酶法 将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联 或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等 5 热处理法定义 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间 使酶固定在菌体内 而制备得到固定化菌体 适用范围 热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化 注意 在加热处理时 要严格控制好加热温度和时间 以免引起酶的变性失活 二 固定化酶的性质酶活力稳定性最适温度最适PH值底物特异性 1 活力固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小 其专一性也能发生改变 例如 用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶 对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30 而对低分子底物苯酞精氨酸 对硝基酰替苯胺的活力保持80 固定化酶的活力降低的原因 酶分子在固定化过程中 空间构象会发生变化 甚至影响活性中心的氨基酸 固定化后 酶分子空间自由度受到限制 空间位阻 会直接影响到活性中心对底物的定位作用 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻 包埋时酶被高分子物质半透膜包围 大分子底物不能透过膜与酶接近 2 稳定性固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好 主要表现在 1 对热的稳定性提高 可以耐受较高的温度 2 对pH的稳定性提高 3 保存稳定性好 可以在一定条件下保存较长的时间 4 对蛋白酶的抵抗性增强 不易被蛋白酶水解 5 对变性剂的耐受性提高 在尿素 有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下 仍可保留较高的酶活力 固定化酶的pH稳定性明显优于游离酶青霉素酰化酶在不同pH的缓冲液中 于37 保温16h测定酶活力 固定化酶在pH5 5 10 3活力稳定 游离酶则仅在pH7 0 9 0稳定 固定化后酶pH稳定性提高的可能原因 固定化后酶分子与载体多点连接 可防止酶分子伸展变形 酶活力的缓慢释放 抑制酶的自降解 将菌与固态载体结合后 酶由于失去了分子间相互作用的机会 从而抑制了降解 3 最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多 活化能也变化不大 有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化 例 用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 其作用的最适温度比游离酶高5 10 同一种酶 在采用不同的方法或不同载体进行固定化后 其最适温度也可能不同 4 最适pH值酶经过固体化后 其作用的最适pH值往往会发生变化 影响固定化酶最适pH值的因素主要有 载体的带电性质酶催化反应产物的性质 1 载体性质对最适pH值的影响 用带负电荷载体制备的固定化酶 其最适pH值比游离酶的最适pH值为高 即向碱性一侧移动 用带正电荷载体制备的固定化酶 其最适pH值比游离酶的最适pH值为低 即向酸性一侧移动 用不带电荷的裁体制备的固定化酶 其最适pH值一般不改变 有时也会有所改变 但不是由于载体的带电性质所引起的 2 产物性质对最适pH值的影响 产物为酸性时 固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些 产物为碱性时 固定化酶的最适PH值要比游离酶的最适pH值低一些 产物为中性时 最适pH值一般不改变 5 底物特异性固定化酶的底物特异性与游离酶比较有些不同 其变化与底物分子量的大小有一定关系 对于那些作用于低分子底物的酶 固定化前后的底物特异性没有明显变化 例 氨基酰化酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 对于那些可作用于大分子底物 又可作用于小分子底物的酶而言 固定化酶的底物特异性往往会发生变化 例 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质 又可作用于低分子的二肽或多肽 固定在按甲基纤维素上的胰蛋白酶 对二肽或多肽的作用保持不变 而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3 左右 以羧甲基纤维素为载体经迭氮法制备的核糖核酸酶 当以核糖核酸为底物时 催化速度仅为游离酶的2 左右 而以环化鸟苷酸为底物时 催化速度可达游离酶的50 60 三 固定化酶的应用已用于工业化生产的固定化酶有 氨基酰化酶 世界上第一种工业化的固定化酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大的固定化酶天门冬氨酸酶青霉素酰化酶 医药工业中应用广泛延胡索酸酶 半乳糖苷酶天冬氨酸 脱羧酶 1 利用固定化氨基酰化酶生产L氨基酸 由化学合成法得到的氨基酸都是无光学活性的DL型外消旋混合物 必须进行光学拆分以获得L型氨基酸 外消旋氨基酸拆分的方法有物理化学法 酶法等 其中以酶法最有效 能够产生纯度较高的L 氨基酸 1969年日本人千畑一郎等通过离子交换法将氨基酰化酶固定在DEAE 葡聚糖载体上 从而制得了世界上第一个适用于工业生产的固定化酶 酶活性高 稳定性好 可用于连续拆分酰化 DL 氨基酸 产物的纯化较简单 收率高 成本低 固定化氨基酰化酶非常稳定 酶的费用减少 固定化氨基酰化酶酶柱的生产工艺还可以自动控制 减少了劳动力费用 2 利用固定化酶合成氨基酸即利用化学法合成分子结构简单的前体 再通过酶反应合成所需要的氨基酸 此法能够价廉 高收率地生产发酵法或化学合成法尚难解决的一些氨基酸 例 酶法合成L 天冬氨酸是以化学法容易合成的氨与富马酸为原料 用大肠杆菌细胞内酶天冬氨酸酶 系一种裂解酶 进行反应定量地合成天冬氨酸 以聚丙烯酰胺凝胶为载体 将具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天冬氨酸酶 用于工业化生产 将延胡索酸转化生产天冬氨酸 或改用角叉菜胶为载体制备固定化酶 也可将天冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来 在用离子键结合法制成固定化酶 用于工业化生产 三 固定化酶的优缺点 极易将固定化酶与底物 产物分开 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应 在大多数情况下 能够提高酶的稳定性 酶反应过程能够加以严格控制 产物溶液中没有酶的残留 简化了提纯工艺 较游离酶更适合于多酶反应 可以增加产物的效率 提高产物的质量 酶的使用效率提高 成本降低 优点 缺点 固定化时 酶活力有损失 增加了生产的成本 工厂初始投资大 只能用于可溶性底物 而且较适用于小分子底物 对大分子底物不适宜 与完整菌体相比不适宜于多酶反应 特别是需要辅助因子的反应 胞内酶必须经过酶的分离手续 第二节细胞固定化 细胞固定化 通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合 制备固定化细胞的过程 固定化细胞 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 固定化细胞能进行正常的生长 繁殖和新陈代谢 所以又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞 微生物细胞 植物细饱和动物细胞都可以制成固定化细胞 目前 随着固定化细胞技术的发展 其实际应用甚至超过了固定化酶 固定化细胞优点 固定化细胞的密度大 可增殖 因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体 不需要微生物菌体的多次培养 扩大 从而缩短了发酵生产周期 可提高生产能力 发酵稳定性好 可以较长时间反复使用或连续使用 有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续生产 发酵液中含菌体较少 有利于产品分离纯化 提高产品质量等 利用的仅是胞内酶 而细胞内多种酶的存在 会形成不需要的副产物 细胞膜 细胞壁和载体都存在着扩散限制作用 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性 固定化细胞缺点 一 细胞固定化的方法分类 吸附法和包埋法1 吸附法 是制备固定化动物细胞的主要方法 载体 硅藻土 多孔陶瓷 多孔玻璃 多孔塑料 微载体等 特点 吸附力较弱 吸附不牢固 细胞容易脱落 使用受到一定的限制 2 包埋法定义 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法 分类凝胶包埋法半透膜包埋法 1 凝胶包埋法凝胶包埋剂 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂 海藻酸钙凝胶 明胶 光交联树脂主要凝胶包埋法 琼脂凝胶包埋法 海藻酸钙凝胶包埋法 角叉菜胶包埋法 明胶包埋法 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 光交联树脂包埋法 琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加到一定体积的水中 加热使之溶解 然后冷却至48 55 加入一定量的细胞悬浮液 迅速搅拌均匀后 趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中 形成球状固定化细胞胶粒 特点 机械强度差 且氧气 底物和产物的扩散比较困难 故使用受限制 海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠 溶于水 配制成一定浓度的海藻酸钠溶液 经杀菌冷却后 与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀 然后用注射器将混悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中 形成球状固定化细胞胶粒 特点 对细胞无毒性 可以通过改变海藻酸钠的浓度改变凝胶孔径 适用于多种细胞的固定化 但磷酸盐会破坏凝胶结构 故使用时需控制培养基中磷酸盐的浓度并保持一定浓度的钙离子 维持凝胶结构的稳定性 角叉菜胶包埋法 将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中 加热溶解 灭菌后 冷却至35 50 与一定量的细胞悬浮液混匀 趁热滴到预冷的氯化钾溶液中 或者先滴到冷的植物油中 成型后再置于氯化钾溶液中 制成小球状固定化细胞胶粒 特点 具有一定的机械强度 若使用浓度低强度不够 可用戊二醛等交联剂做交联处理 进行双重固定化 此包埋法操作简便 对细胞无毒害 通透性能较好 明胶包埋法 配制一定浓度的明胶悬浮液 加热溶化 灭菌后 冷却至35 以上 与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀 冷却凝聚后做成所需形状的固定化细胞 特点 若机械强度不够时 可用戊二醛等双功能试剂交联强化 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液 与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀 然后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺 混合后让其静置聚合 获得所需形状的固定化细胞胶粒 特点 机械强度高 可通过改变丙烯酰胺的浓度调节凝胶孔径 适用于多种细胞和酶的固定化 但丙烯酰胺单体对细胞有毒害作用 故应缩短聚合时间 减少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间 光交联树脂包埋法 选用一定相对分子量的光交联树脂预聚物 加入1 左右的光敏剂 加水配成一定浓度 加热至50 左右使之溶解 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀 摊成一定厚度的薄层 用紫外光照射3min左右 即可交联固定化制成固定化细胞 然后在无菌条件下 切成一定形状 特点 通过选择不同分子量的预聚物可使聚合而成的树脂孔径得以改变 适合于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化 光交聚树脂的强度高 可连续使用较长的时间 用紫外光照射几分钟就可完成固定化 二 固定化微生物细胞的应用 应用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物 利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极 三 固定化植物细胞固定化植物细胞特点 固定化后由于有载体的保护作用 可减轻剪切力和其他因素的影响 提高其存活率和稳定性 细胞经固定化后 被束缚在一定的空间范围内进行生命活动 不容易聚集成团 固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液 可反复使用或连续使用较长的一段时间 大大缩短生产周期 提高产率 易于与培养液分离 利于产品的分离纯化 提高产品质量 植物细胞固定化的方法 吸附法 将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内 或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上 包埋法 包埋法是将植物细胞包埋在琼脂 角叉菜胶 海藻酸钙凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 明胶等多孔凝胶之中 包埋方法与微生物细胞包埋方法基本相同 四 动物细胞固定化1 固定化动物细胞特点 提高细胞存活率 提高产率 可反复使用或连续使用较长的时间 利于连续化自动化生产 易于与产物分开 利于产物分离纯化 提高产品质量 2 动物细胞固定化的方法 1 吸附法 大多数动物细胞属于附着细胞 它们在培养过程中 必须趋向于附着在固体表面 故此法特别适合于动物细胞的固定化 常用的吸附固定化载体有转瓶 微载体和中空纤维等 转瓶法转瓶由玻璃或塑料制成 表面经过一定方法处理而带上电荷 如用高锰酸钾等氧化剂 强酸 强碱或紫外光照射等进行表面处理 可使动物细胞容易附着在其表面生长 培养时 转瓶以一定的速度转动 特点 转瓶培养的设备简单 操作容易 但比表面积较小 细胞的生长繁殖受到限制 可在转瓶内加列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加 从而提高生产能力 微载体法微载体 指颗粒细小的固定化载体 直径一般为l00一200um 相对密度接近1 0 由带有表面电荷的葡聚糖 明胶 纤维素 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯或玻璃等材料制成 特点 可用于多种动物细胞的固定化 用于生产 干扰素 人组织纤溶酶原活化剂 白细胞介素以及各种疫苗等 具有很大的表面积 比转瓶的比表面积大几百倍 对细胞的生长和物质传递非常有利 但是固定化细胞的强度不够 容易破碎 使用时间较短 中空纤维法中空纤维由聚丙烯 硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成 纤维管壁是半透膜 使用时 将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间 细胞附着在中空纤维外壁 培养液在中空纤维管内流动 各种营养成分 溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递 特点 这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似 中空纤维起着相当于体内微血管的作用 对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜 中空纤维成本较高 有时会发生纤维管堵塞现象 大规模生产的难度较大 中空纤维固定化适用于动物附着细胞 也适用于悬浮细胞培养 2 包埋法 一般适用于悬浮细胞 根据载体和方法的不同 有凝胶包埋法和半透膜包埋法 凝胶包埋法 利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化 细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢 由于有载体的保护 动物细胞有较好的稳定性 可显著提高其存活率 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有 琼脂糖凝胶海藻酸钙凝胶血纤维蛋白 半透膜包埋法 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋 形成微囊型固定化动物细胞 半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变 制备过程一般采用海藻酸钙 聚赖氨酸包埋技术 动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋 制成直径1 2mm的胶粒 再用聚赖氢酸处理 使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜 然后将它泡在柠檬酸钠溶液中 使海藻酸钙凝胶溶解 便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞 第三节原生质体固定化 固定化细胞的局限性 只能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物 由于载体的影响 使营养物质和产物的扩散受到一定的限制 在好气性发酵中 溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素原生质体固定化 原生质体很不稳定 容易破裂 有可能增加细胞膜的通透性 可使较多的胞内物质分泌至细胞外 实现某些胞内产物的生产 由于去除了细胞壁这一扩散障碍 有利于氧的传递 营养成分的吸收和胞内产物的分泌 一 原生质体的制备制备时注意 在破坏细胞壁的时候 不能影响到细胞膜的完整性 更不能使细胞内部的结构受到破坏 因此只能使用对细胞壁有专一性作用的酶 不同种类的细胞 由于各自细胞壁的组成 结构和性质不同 原生质体的制备方法也不一样 为防止原生质体破裂 需加入合适的渗透压稳定剂 选用对数生长期的细胞以获得较高的原生质体形成