酶的分离技术及进展.doc

酶工程酶的分离纯化技术及进展摘要：随着工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题，本文介绍了沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等常规方法和反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等新型技术在分离纯化酶的应用。此外，随着对工业用酶要求的提高，常规方法和新颖方法的结合也为分离纯化酶提供了高效的分离纯化效果。关键词：酶分离技术 生物分离一.引言酶作为生物催化剂，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等催化特点,在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领域有着广泛的应用1。大多数工业用酶都由微生物发酵得到，且随着发酵技术的优化已能成功进行大规模生产。随着蛋白类临床治疗药物和工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题。 酶的分离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开而获得与使用目的要求相一致的有一定纯度的酶产品的过程。常规的微生物酶分离纯化方法有沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等，新兴的分离技术，如反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等在分离纯化酶的应用上也取得了一定进展。此外，利用常规方法和新颖方法相结合的分离技术为分离纯化酶提供了新的方法。二.分离纯化酶的常规方法纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的位置和次序，为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及分离次序的选择也至关重要。一般的分离次序遵循以下原则：将含量较多的杂质用尽量简单且经济的方法先分离出去，如沉淀、过滤和吸附；将费时又昂贵的工艺放在最后阶段。因此在分离纯化酶之前通常需要对发酵液进行预处理，对于胞外酶，发酵液经离心或过滤除掉细胞,上清液用超滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂抽提等方法浓缩；胞内酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用硫酸铵沉淀的浓缩方法。进一步分离纯化酶的常规方法有凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱和亲和色谱，它们的技术特点及用途如表12所示。离子交换、疏水性相互作用色谱和亲和色谱通常可起到蛋白质的浓缩效应，而凝胶过滤常常使样品稀释。凝胶过滤和离子交换属于常规分离方法，在此不再赘述；疏水性相互作用色谱和亲和色谱属于生物分离色谱，分别利用蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别和耦联亲和配基与吸附目标产物之间的亲和作用进行蛋白质类生物大分子分离纯化的生物色谱。亲和色谱是蛋白质检测中最专一的分离技术，环肽抗生素通常被认为是蛋白酶的一种亲和配体3，能高效分离酶、抗体、激素等生物物质，Linda等4利用亲和色谱蛋白质捕获技术分离了凝血酶。表1 常用分离纯化酶的方法Table 1 The common methods of separation in purifying enzyme分离方法分离原理特点用途凝胶过滤分子大小分辨率适中，分级分离时流速较慢，脱盐时流速快，但容量受样品体积限制适用于纯化的后期阶段，脱盐可用于任何阶段，特别是步骤衔接时的缓冲液更换离子交换电荷分辨率较高，视支持物不同流速可很快，容量大，不受样品体积限制最适用于大体积样品且蛋白纯度较低的样品早期纯化，可分批操作疏水相互作用色谱疏水极性分辨率较高，流速快，容量大，不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段，特别适用于离子强度较高的样品，如沉淀、离子交换后的样品亲和色谱亲和作用分辨率极高，流速快，容量视配体可大可小，不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段，特别是样品浓度小、杂质含量多时，可以减少纯化步骤三.分离纯化酶的新兴技术常规的纯化方法耗时、得率低，因此诸如反胶团萃取、膜技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等一些新的分离纯化技术越来越受到学者们的重视。1 反胶团萃取技术当有机溶剂中加入的表面活性剂浓度超过其临界值时，表面活性剂会在有机溶剂中形成由极性头聚集朝内形成内表面，非极性尾伸向外围有机溶剂形成外表面，从而形成大小为毫米级的稳定聚合体，即反胶团。该反胶团的内腔含有水分，在适宜的pH环境下，蛋白质与反胶团极性头呈相反的电荷，这种静电引力能使蛋白质从水相迁移到有机溶剂的反胶团内，从而溶解诸如蛋白质、核酸等极性物质，实现对蛋白质的有机溶剂萃取。-半乳糖苷酶是一种分子量大、亲水性好的球状酶，可以催化水解牛奶中的乳糖类碳水化合物，在食品应用中具有重要商业意义。由于乳糖的水解液可以用于日常产品和不耐乳糖的人群，-半乳糖苷酶也能使乳糖转化为其他更具有商业价值的糖，因此需要获得高效且易操作的生物分离方法从其他蛋白质中分离纯化初-半乳糖苷酶。在液化-半乳糖苷酶时需要考虑缓冲液的类型、pH、蛋白质浓度，又由于当缓冲液浓度在40 mmol以上时-半乳糖苷酶能被大量排斥在微乳剂小液滴外。Mazi等5便根据这一特性使用由气溶胶（AOT）和戊烷形成的胶团一步分离得到了-半乳糖苷酶。首先将含蛋白的水溶液注入AOT/戊烷溶液中，料液中蛋白质的质量要稍微大于其在水中的溶解度。高速离心后的杂蛋白被包裹在由有机相形成的微乳剂小液滴里，而大分子量的目标蛋白就被排斥并进入新相，即过含水相。该实验又研究了盐浓度对从-乳球蛋白溶液中提取-半乳糖苷酶的影响，结果表明溶液中KCl的浓度在100 mmol时，反胶团对-乳球蛋白的携带能力最大而对-半乳糖苷酶的携带能力最小，在此条件下纯化的酶的活性和纯度都最高，且分离的酶中有92%可以恢复酶活。2 膜分离技术膜分离技术是指在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时实现选择性分离的技术。由于膜分离技术兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、操作简单等特征，目前已广泛应用于食品、医药、生物、环保、冶金、能源等领域。膜分离技术错流膜过滤中，微生物发酵液以横过膜表面的方式流动，液流可以清扫膜表面的溶质层，使溶质无法在膜表面处积聚，从而截留微生物细胞、浓缩含有酶的发酵液，是下游处理技术中的常用技术。Sztajer等6用毛细管超滤膜纯化了假单胞杆菌脂肪酶，并比较了聚丙烯腈（PAN）和聚砜（PS）2种毛细管超滤膜对脂肪酶的浓缩作用，结果表明PAN浓缩倍数为15，PS只能浓缩3倍。因此，对PS而言，因为仅观察到浓缩效果，故适合浓缩酶；而PAN除了浓缩，还能除去杂蛋白。Beier等7使用振动中空薄膜组件分离酶和酵母细胞，实验结果表明振动微量过滤中空薄膜组件在低跨膜压力、低交叉速度和高的酶传导下能从面包酵母中成功分离出大分子酶。3 免疫纯化技术免疫纯化技术作为一种高效选择性的蛋白质纯化技术，大部分应用单克隆抗体和多克隆抗体，通过抗体对目标蛋白的特异性及杂蛋白的特异性程度进行分离纯化。高特异性的抗体能够高效区分相似的抗原，解决常规方法的分离困难。目前，通过一步免疫纯化可以得到的纯化倍数为1000-100008。Bandmann等9在大肠杆菌突变体的N末端引入IgG结合位点，通过构建融合蛋白，利用IgG与靶位点特异性结合的免疫方法纯化了大肠杆菌突变体表达的脂肪酶突变体角质酶。4 双水相萃取技术双水相萃取法于1978年由Kula等提出，主要用于酶和蛋白质的萃取。所谓双水相是指当2种水溶性聚合物或者是聚合物与盐混合时，由于聚合物水溶液的疏水性差，易发生相分离产生两相。常见的双水相体系有聚乙二醇/葡聚糖体系、聚乙二醇/磷酸钾体系和聚乙二醇/硫酸镁体系。其中，聚乙二醇和葡聚糖这类无毒聚合物可作为蛋白质和酶的稳定剂，且形成的两相中水的质量分数均在70%以上，为蛋白质的溶解和抽提提供了适宜的环境，同时也使蛋白质和酶的活性不易损失。双水相萃取所需设备简单，仅需一个可使粗提液与两相系统充分混合及放置的储罐和一个普通离心机即可。因此此法在应用初期仅用于粗提取液的处理，但通过研究发现经过几次连续双水相萃取后，产品可以达到很高的纯度。因此，随着技术的进一步完善，双水相萃取技术不仅可用于澄清发酵液的酶分离，还特别适用于直接从含有固体细胞的原始发酵液和带有细胞碎片的细胞匀浆液中提取纯化酶。同时，由于此法不用对发酵液进行特殊处理就可以与后续提纯步骤相衔接，所以能使提纯工艺更为有效、连续与经济。据文献报道，双水相萃取技术已成功应用于大规模分离纯化微生物碎片中的甲酸脱氢酶，收率在90%以上，纯化倍数最大可到8倍左右10。5 超临界流体萃取技术超临界流体萃取是指用超临界流体为溶剂，从固体或者液体中萃取可溶组分的传质分离过程，超临界流体是一种介于气体和液体之间的流体。目前，超临界流体萃取技术已广泛应用于在从石油渣油中回收油品，从咖啡中提取咖啡因等工业中。超临界流体萃取不用一般的羟基类溶剂，而是使用在超临界状态下的液态气体，如超临界液态CO2、甲烷、乙烷、乙烯等。超临界液态CO2因为无毒、不燃、无腐蚀、低黏度、价廉且渗入物质的能力极强、扩散系数大、可获得高传递速率,容易从产品中分离11等优点受到广泛应用。尤其是溶质在液体中的溶解度随温度和压力的变化很大，利用超临界液体萃取可方便地通过改变温度和压力的方法来进行萃取或回收溶剂。6 大规模电泳技术电泳技术已在无机化学、有机化学、生物化学、分子生物学等学科中成为分离鉴定各种带电物质的重要手段，也是工业、医药、科研常用的快速又准确的分离分析方法。在酶工程领域中，电泳技术主要应用于对酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定以及小批量的分离纯化。随着生产的扩大化，大规模电泳技术的发展为工业分离纯化酶提供了一种很好的方法，目前自由流动电泳和膜固定pH梯度等电聚焦法已在工业中得到应用。自由流动电泳是制备规模的连续分离生物分子和颗粒的技术。在自由流动区带电泳技术中，具有一定pH和电导的电解质连续导入电泳池顶部的层流中，样品流也连续注射入电解质流中，与电解质流垂直的电场按电泳迁移率的差别分离样品。此法已用于从抽提液中分离甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲醇氧化酶等。膜固定pH梯度等电聚焦法与普通凝胶电泳相比，克服了凝胶色谱负载量和回收率较低、且产品易受未聚合的毒性单体污染等缺点，让样品在pH固定的2个凝胶面之间循环，只有杂质可以通过凝胶，目的蛋白质由于处于等电点而不进入凝胶中，因此处理样品的速度快、纯度和回收率高12。7 二维色谱技术和联用技术随着分离技术的发展和对生物产品要求的提高，各种联用技术的应用日益广泛。二维或多维色谱技术的概念由Giddings在1984年提出，即组合不同的分离模式构建多维分离系统，如GCGC、LCLC等。联用技术也是近些年来发展迅速的一种新型色谱技术，是色谱与其他高性能检测技术联用的技术，其中色谱/质谱联用是最成功的联用技术之一。该技术将色谱对复杂样品的强大分离能力和质谱技术具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量的优点结合起来。目前，二维色谱和联用技术已在生命科学、环境和药物分析等领域得到应用。高效液相亲和色谱技术就是二维色谱的应用之一，是将亲和色谱的高分辨力和液相色谱的快速检测相结合的新型分离纯化技术，目前已经能大规模应用于分离工程。由Kalbfuss等12开发出的涂有NAD配体的葡聚糖亚微米无孔硅胶纤维柱，能在30 min内从抽提液中吸附乳酸脱氢酶，洗脱后可以得到纯度大于99%的酶，且纤维柱可再生使用。四.总结工业用酶的纯度要求不高，过度的纯化反而会提高成本并且降低回收率；而临床医学用酶的纯度要求较高，因此纯化的设计应考虑纯化量和应用纯度的级别、酶蛋白的来源、纯化设备的可行性、重复性及经济性等，同时更要考虑根据目标酶的性质设计不同的策略。随着新型分离材料、新型分离设备、高度自动化和智能化仪器的出现，酶的分离纯化也进入了新的发展阶段。世界各国的学者研究开发出更为先进、灵活的分离纯化技术，为纯化天然酶、重组酶、人工模拟酶和杂合酶提供了高效可行的方法，分离技术的日趋成熟减少了纯化步骤并提高了回收率，传统方法与新颖方法的结合也为酶的分离纯化注入了新的活力。同时，酶的复性、空间折叠、修饰加工的发展也对下游分离纯化工艺提出了更高的要求。参考文献1 Hasan F., Shah A.A., Hameed A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(2): 235-251.2 阎金勇, 丁双, 杨江科, 闫云君. 微生物酶分离纯化研究进展. 现代化工, 27(6): 19-24.3 Granet O.I., Bertrand O. Separation of proteases: old and new approaches. Journal of Chromatography B, 1996, 684: 239-263.4 Linda B., Adam C. Aptamer stationary phase for protein capture in affinity capillary chromatography. Journal of Chromatography A, 2006, 1111(2): 115-119.5 Mazi B.G., Hamamci H., Dungan S.R. One-step separation of -galactosidase from -lactoglobulin using water-in-oil microemulsions. Food Chemistry, 2012, 132: 326-332.6 Sztajer H., Bryjak M. Capillar membranes for purification of Pseudomonas fluorescens lipase. Bioprocess Engineering, 2003, 4: 257-259.7 Beier S.P., Jonsson G. Separation of enzymes and yeast cells with a vibrating hollow fiber membrane module. Separation and Purification Technology, 2007, 53: 111-118.8 闵玉涛, 王云龙, 李晨阳, 等. 抗FLAG标签单克隆抗体的制备鉴定及初步应用. 中国生