基因治疗 Gene therapy

1 九 基因治疗Genetherapy 2 一 基因治疗的发展简史 概念及背景 二 基因治疗的基因导入系统 三 基因治疗的途径 四 基因治疗的靶细胞研究 五 基因治疗在遗传病治疗上的应用和肿瘤基因治疗 六 基因治疗的发展方向 3 一 基因治疗的发展简史 概念及背景 4 基因治疗的发展简史 5 基因治疗的概念 经典 针对遗传病某一基因缺陷 将外源基因导入体内予以矫正 现在 凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法 6 上世纪九十年代初 一位因ADA 腺苷酸脱氨酶 基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩 由美国国立卫生研究院用ADA基因治愈 基因治疗 研究热从此波及全世界 起而效颦 为保障人类健康展现了美好的前景 7 截止到2011年 基因治疗试验的全球 国家分布 基因治疗的疾病类型 基因治疗试验的临床阶段 1989 2009年12月 每年全球被批准的临床数目 8 9 10 11 12 13 14 15 世界第一个基因治疗药物在中国诞生 人民网深圳2003年10月22日15 30急电正在这里召开的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的消息 世界首个基因治疗药物在中国诞生 深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药 重组人p53腺病毒注射液 商品名 今又生 10月16日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书 这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平 在国际竞争中抢占了先机 赛百诺公司负责人说 这种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因治疗药品 可望明年一月正式上市 16 根据靶细胞的类型分类 1 生殖细胞 germcell 基因治疗 2 体细胞 somaticcell 基因治疗根据基因转移的途径分类 1 invivo 活体直接转移或称一步法 2 exvivo 回体转移或称二步法 基因治疗的种类 17 1 基因置换基因置换就是用正常的基因原位置换病变细胞内的致病基因 使细胞内的突变致病基因完全恢复正常状态 这种基因治疗方法最为理想 但这种方法是建立在同源重组技术基础上的 而目前同源重组虽然在技术上可行 但重组的效率很低 远没达到基因治疗要求的水平 在临床试验上就更无法实现了 基因治疗的策略 18 2 基因修复基因修复是指将致病基因的突变碱基序列定点纠正 可用来治疗点突变导致的疾病 但由于纠错效率低的原因 实践中有相当的难度 19 3 基因增补将目的基因导入患者体内 其表达产物能补偿缺陷细胞的功能 可用于隐性遗传病的治疗 20 4 基因失活利用反义技术特异性封闭 抑制有害基因表达 可用于一些显性遗传病或肿瘤的基因治疗 21 AndrewZ Fire CraigC Mello 22 1998年AndrewZ Fire CraigC Mello等发现将很少量的双链RNA注入秀丽线虫体内 即可高效 特异地阻断 抑制与双链RNA同源的基因表达 其阻断 抑制率比纯化后的反义RNA技术高若干个数量级 双链RNA导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA发生特异性降解 进而使相应基因抑制的转录后基因沉默现象称RNA干扰 23 双链RNA特异性核酸内切酶 dsRNA specificendonuclease Dicer 切割 形成21 23nt的双链短干扰RNA short interferenceRNA siRNA siRNA链为5 端磷酸化 3 端有二个碱基以非配对方式悬垂 24 siRNA与由蛋白及酶类组成的RNA诱导沉默复合体 RNA InducedSilencingComplex RISC 结合后 由于RISC具有解旋酶活性 siRNA中的正义链和反义链解旋 解链 随后正义链被降解 而与RISC结合的反义链则按照碱基互补配对原则与靶mRNA中的同源序列结合 并由RISC发挥核酸内切酶作用 在距siRNA3 断11或12个碱基处切割靶mRNA 25 倍增放大作用 siRNA一方面可引导RISC特异性切割靶mRNA 另一方面 siRNA还可作为引物与靶mRNA结合 在RNA依赖性RNA多聚酶 RNA dependentRNApolymerase RdRp 的作用下合成新的ds RNA 再次经Dicer酶切割 形成新的siRNA 并作用于靶mRNA 26 RNA干扰 27 微小RNA microRNA 微小RNA microRNA 大量存在人类基因组中的非编码RNA 能特异识别成熟mRNA的3 非翻译区 抑制mRNA的翻译 微小RNA microRNA 1993年Lee等在对秀丽线虫进行突变体的遗传分析中首次发现的不能编码蛋白质 但能时序调控其胚胎后期发育基因表达的miRNA Lin一4 28 2000年Reinhart等在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA let一7 后来发现了大量类似RNA 2001年起统一称为miRNA 29 miRNA通常来源于一个大小约为1000bp的长链RNA初始转录产物 Pri一miRNA Pri一miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70 100nt的具有茎环结构的RNA分子 pre一miRNA pre一miRNA在转运蛋白一5 Exportin一5 的作用下转运至胞质中 被另一个双链RNA特异性核酸酶Rnaselll Dicer识别 进一步被切割成长约22nt的小分子RNA 即成熟的miRNA 成熟miRNA在RNA诱导的沉默复合物引导下 当与mRNA完美互补时 miRNA便指导mRNA特异性切割 当两者没有足够的互补性时 miRNA则抑制mRNA转录后翻译 30 随着人类后基因组计划的进一步开展 占类基因组90 以上的非编码序列越来越引起科学家的关注 据计算推测 人类基因组可能存在1000多个miRNA基因 单个miRNA可调控200多个靶基因 约1 3的蛋白编码基因受miRNA调控 31 miRNA是调节真核生物基因表达的天然反义寡核昔酸链 研究表明 miRNA参与了生命过程中一系列的重要过程 包括发育进程 造血过程 器官形成 细胞增殖和凋亡等 与许多疾病的发生 诊断 治疗和预后密切相关 miRNA也因而成为当前研究的新热点 32 5 免疫调节将抗原 抗体或细胞因子基因导入患者体内 改变其免疫状态 达到预防和治疗疾病的目的 如可将白细胞介素 2 IL 2 导入肿瘤病人体内 提高病人 IL 2 的水平 激活体内免疫系统的活性 33 许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原 将这些在正常机体内并不表达的肿瘤特异抗原的编码基因转入肿瘤内 制备成肿瘤DNA瘤苗 再导入患者体内 通过其在机体内的表达可以激发机体对编码抗原的免疫反应 如黑色素瘤相关抗原MAGE 在多种肿瘤中表达的癌胚抗原CEA 病毒基因产物HPV E6 E7等 34 6 其他方法增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 然后给予病人无毒性核苷类似物GCV 甘昔洛韦 ganciclovir 的药物前体 由于只有含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物 因而肿瘤细胞被杀死 而对正常细胞影响不大 35 由于基因治疗的人体试验引发了争论 为了规范这一新生事物 使其更好地为人类健康服务 但同时又在人类伦理学的接受范围内 1975年美国国立卫生研究院 NIH 召集和组织了重组DNA顾问委员会 RecombinantDNAAdvisoryCommittee RAC 制定了一系列有关重组DNA研究的法规 接着RAC又任命了一个人体基因治疗的分委员会 HumanGeneTherapySubcommittee 并于1985年颁布了一个权威性的文件 称为 人体细胞基因治疗方案的设计和提请批准的注意要点 该文件要点如下 基因治疗的守则 36 1 什么病可以采用基因治疗 即被治疗的疾病是否严重到必须要用这种全新和从未尝试过的疗法 试图增加一个人的能力而不是治疗疾病 将立即被否决 37 2 该病目前是否有其他治疗方法 要求基因治疗必须用于目前尚无满意疗法的疾病 在其他所有因素均等同的情况下 基因治疗应较其他疗法更有效 38 3 根据已有的实验室和临床研究 基因治疗对于患者及其子女和接触者的安全性如何估计 即基因治疗的安全性必须有保证 39 4 根据已有的实验室和临床研究 基因治疗的疗效预计将如何 即基因治疗的有效性在进行人体试验前要有足够的动物试验证据 40 5 如果满意地回答了上述4个问题 那么如何公正地选择受试者 6 如果上述5个问题都有满意的答案 那么医生将如何把基因治疗的各种情况恰当正确地告知患者 以及他们将如何表达同意和不同意 即要保证患者的知情同意权 41 7 在满意地回答了上述所有问题后 将采取什么步骤来保护接受基因治疗患者的隐私权 临床申请的基因治疗方案经过审议 如果不符合这些条件 则禁止实施 42 二 基因治疗的基因导入系统 43 1 基因治疗的载体质粒载体包含哺乳动物细胞的表达调控元件和细菌胞浆内进行复制元件 也称穿梭载体 shuttervector 指在哺乳动物细胞和原核生物细胞中均能稳定复制 稳定存在的基因载体 脂质体 44 病毒载体将野生型病毒进行遗传改造 去掉其毒性并携带治疗的目的基因 逆转录病毒 RV 载体腺病毒载体 Ad 腺相关病毒 AAV 载体单纯疱疹病毒 HSV 载体 45 2 基因转移的方法1 物理法 1 显微注射法 2 电穿孔法 electroporation 3 颗粒轰击技术 基因枪 46 2 化学法 1 脂质体介导的DNA转移法 liposome mediatedDNAtransfer 2 磷酸钙转染法 transfectionofcalciumphosphate 47 脂粒与细胞膜之间四种可能的相互作用形式1 膜间传递2 吸附3 细胞吞噬4 融合 48 3 生物法 生物法主要是指病毒介导的基因转移 对病毒基因进行改建 去除其部分 甚至大部分 基因 将外源基因插入 并转染能表达该病毒部分蛋白 外壳 核壳蛋白及聚合酶 的细胞 称包装细胞 后组装成假病毒 49 三 基因治疗的途径 50 根据基因转移的途径分类 1 exvivo 回体转移或称二步法 将人体细胞从体内取出 基因改造 再移植到人体中 自体 同种异体 异种细胞 同种异体或异种组织和器官等 2 invivo 活体直接转移或称一步法 直接将基因转移到人体中 如DNA注射 口服 喷雾等 有如普通治疗药物 商业化发展方向所在 51 基因治疗的exvivo途径 家族性高胆固醇血症是由于肝细胞表面低密度脂蛋白 LDL 受体缺乏所致 取出一小部分肝脏 打碎体外培养 用反转录病毒携带的LDL受体基因转染培养细胞 将整合有LDL受体基因的肝细胞通过门静脉输回肝脏 52 基因治疗就向打针和吃药一样 基因治疗的invivo途径 53 在大多数基因治疗临床试验中 来自患者血液或骨髓的细胞在实验室中培养 这些细胞被暴露在带有目的基因的病毒中 病毒进入细胞后 目的基因就成为宿主细胞DNA的一部分 这些细胞在实验室培养后 通过静脉注射重新回到患者体内 这类基因治疗被称为exvivo 就是 体外 的意思 基因是被运送到患者细胞中 但这些细胞存在于患者体外 在其他研究中 载体或脂质体被用于将目标基因运送到患者体内的细胞中 这种基因治疗被称为 体内 invivo 54 四 基因治疗的靶细胞研究 55 基因治疗的靶细胞 器官 1 基因缺陷的细胞 如受体缺陷细胞 肿瘤细胞等原位细胞 2 广泛的细胞类型 造血干细胞皮肤成纤维细胞血液淋巴细胞肌细胞肝细胞骨髓基质细胞 56 根据靶细胞的类型分类 1 生殖细胞 germcell 基因治疗 2 体细胞 somaticcell 基因治疗 57 1 生殖细胞基因治疗 生殖细胞基因治疗 germcellgenetherapy 是将正常基因转移到患者的生殖细胞 精细胞 卵细胞 早期胚胎中 使其发育成正常个体 由于有着床前诊断技术 生殖细胞基因治疗已无必要 58 2 体细胞基因治疗 体细胞基因治疗 somaticcellgenetherapy 是指将正常基因转移到体细胞 使之表达基因产物 以达到治疗目的 这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位 用健康的基因确切地替换异常的基因 使其发挥治疗作用 同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性 对特定座位基因转移 目前还有很大困难 59 体细胞基因治疗目前采用将基因转移到基因组上非特定座位 即随机整合 只要该基因能有效地表达出其产物 便可达到治疗的目的 这不是修复基因结构异常而是补偿异常基因的功能缺陷 这种策略易于获得成功 基因治疗中作为受体细胞的体细胞 多采取离体的体细胞 先在体外接受导入的外源基因 在有效表达后 再输回到体内 这也就是间接基因治疗法 60 五 基因治疗在遗传病治疗上的应用和肿瘤基因治疗 61 1 单基因疾病的基因治疗 1 腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症 是一种很少见的基因疾病 正常的腺苷脱氨酶 ADA 基因可以产生一种叫做腺苷脱氨酶的酶 而这种酶是人体免疫系统有效运行的基础 患有腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症的病人没有这种基因完整无缺的复制品 而他们有缺陷的复制品不能产生有效的腺苷脱氨酶 ADA 62 腺苷脱氨酶 ADA 缺乏的孩子一生下来 就患有严重的免疫缺陷 很容易被严重感染 即使是最轻微的病菌性疾病 也会引起可怕的后果 如果不及时治疗 这种疾病会导致小生命夭折 虽然可以替换腺苷脱氨酶 ADA 但效果很有限 63 腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症被选为人类第一个批准的基因治疗试验有几个原因 首先 这种疾病是由单个基因的缺陷所引起 因此增加了基因治疗成功的可能性 其次 这种基因控制很简单 千篇一律 不象其它许多基因那样控制复杂 最后一点是 虽然正常基因产生的少量酶在临床上就有作用 但是量大也没有什么害处 因此 腺苷脱氨酶 ADA 产生的量并不需要精确控制 64 腺苷脱氨酶 ADA 基因治疗试验开始于1990年9月 两个小孩接受了治疗 取得了令人满意的效果 最初用来治疗患有腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症的病人的基因疗法是定期给病人输入自体经过改良的T型淋巴细胞 65 这些白细胞被放在实验室里 用白细胞间介素 2 T型淋巴细胞制成的生长素 和单克隆抗体 在实验室制成的有特定目的的 作营养剂进行组织培养 人体正常的腺苷脱氨酶 ADA 基因借助于载体 一种遗传工程上用的功能已丧失的老鼠逆转录酶病毒 被导入T型淋巴细胞 筛选出成功转变 遗传上已改变 的细胞并培养10天左右 以增加它们的数量 然后把这些细胞象输血一样通过静脉输入病人体内 66 在研究的前10个月 整个过程 取出T细胞 在实验室进行修正 再输回病人体内 每隔6 8周重复一次 10个月过后 再继续每隔6 12个月进行细胞输入一次 试验结果显示 这两个小孩的免疫功能都有很大提高 最近 研究人员对其中的一个小孩进行改变基因的骨髓干细胞治疗 干细胞是可以产生各种血细胞并具有自我更新能力的 母 细胞 改变了遗传物质的干细胞可以完全且永久纠正许多血液和免疫系统的紊乱 而改变了遗传物质的白细胞仅能部分纠正这些病症 并需重复治疗 67 科学家还不清楚怎样把干细胞从骨髓中分离出来 但他们已开发出骨髓和外围循环血液营养丰富的方法 使这些重要细胞的浓度得到提高 脐带血含有丰富的干细胞 目前 研究人员正在用取自脐带血液并已改变了基因的干细胞 对三个刚出生不久的患有腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症的婴儿进行治疗 68 目前 许多省市已成立了脐带血造血干细胞库 脐血干细胞可治疗红斑狼疮 类风湿关节炎 糖尿病 帕金森综合症 白血病 恶性肿瘤等数十种疑难杂症 69 2 血友病B 是基因治疗的模式病种之一 常规治疗以输血和血制品为主 既会引起严重输血反应 还容易感染病毒 此外还因凝血因子在血液中半衰期短 需要经常性输入 不仅不方便而且治疗费用昂贵 基因治疗为血友病B的治疗开辟了一条新的途径 70 血友病B是基因治疗的理想病种 其发病的生化和遗传机制已被阐明 而且hFIX是分泌型蛋白 能在多种组织中被表达 加工和分泌 基因治疗的靶组织选择范围广 另外 血友病B的基因治疗对靶细胞表达量的要求不高 只要达到正常人hFIX血浆浓度的10 约500ng mL 左右 就能治愈患者凝血功能的缺陷 同时血友病B有基因剔除的动物模型 有成熟的hFIX表达量和凝血活性的测定方法 便于进行基因治疗的疗效评价 71 目前 血友病B的基因治疗取得了一定的进展 但在大动物和人体试验的结果还不够理想 需进一步提高hFIX的表达水平以提高治疗的有效性和安全性 72 3 Gaucher氏病 GD 是一种常染色体隐性遗传病 因编码葡萄糖脑苷酯酶 GC 的结构基因突变 导致该酶的缺乏 葡萄糖脑苷酯堆积在溶酶体中 引起细胞死亡和脏器功能衰竭 73 美国NIH分别于1993年和1994年批准Barrangel Karlsson和Schuening各自领导的三个研究组进行GD基因治疗临床试验 他们或采用适合于骨髓细胞表达的MFG载体表达GC基因 或采用扩增型高滴度反砖录病毒基因转移系统感染骨髓细胞 或分离外周血造血干细胞进行GC基因转移 均取得了高效转移和表达 74 2 肿瘤基因治疗 1 抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入疗法科学家正在研究从基因的角度来改变抵抗癌症的免疫细胞 他们设想用抗癌基因 武装 这些细胞后再送回人体 以便能更有力地攻击癌瘤 按照这种思路进行的临床试验正用于治疗恶性黑素瘤 从人体中取出癌细胞并进行基因改造 使它们免疫反应加强 然后再把它们输回人体作为癌症疫苗 使用这种方法的各种临床试验都正在进行 75 2 细胞因子基因转移抗肿瘤免疫效应细胞将细胞因子基因 如IL 2 IL 4 IL 1 IL 6 IL 7 IL 12 INF TNF G CSF GM CSF等 导入抗肿瘤的免疫效应细胞 如TIL tumorinfiltratinglymphocyte 肿瘤浸润淋巴细胞 LAK lymphokineactivatedkillercell 淋巴因子活化的杀伤细胞 及CTL cytotoxotityTlymphcyte 细胞毒T淋巴细胞 细胞中 以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力 这实际上是免疫治疗和基因治疗技术的组合 一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次 副作用大等缺点 疗效也有所提高 76 3 细胞因子基因转移肿瘤细胞 77 4 自杀基因 疗法将 自杀基因 suicidegene 导入肿瘤细胞 其能将无毒性前体药物在肿瘤细胞内代谢为毒性产物 进而选择性的杀伤肿瘤细胞 能够编码产生将非活性或无毒性前体药物转化成活性活毒性药物的酶的基因 称 自杀基因 78 自杀基因 的种类及作用机制 79 3 心血管基因治疗 心血管基因治疗 VEGF165 血管内皮生长因子 对于血管的生成具有重要作用 而一些心脑血管疾病由于血管堵塞 狭窄导致 可以采用该策略进行血管再生 旁路再通 使病人免受开刀搭桥之苦 美国已经有多项方案进入临床试验 临床试验结果显示 新血管生长 心肌血流灌注和室壁功能改善 大多数病人的心绞痛减轻 80 六 基因治疗的问题 81 不幸的悲剧 基因治疗一人死亡 1999年10月美国宾州大学JMWilson在开展腺病毒OTC 鸟氨酸氨甲酰基转移酶 基因治疗肝脏遗传病时 一位亚利桑那州的十八岁的青年Gelsinger接受了高剂量治疗后死亡 FDA调查 18点问题 知情同意 及时汇报 草率 FDA终止试验 媒体社会群起攻之 科学家保持沉默 内心呼吁理解 基因治疗前景 基因治疗是不是一场梦 82 2000年用反转录病毒为载体 治疗11例X 连锁严重联合免疫缺陷患者 有9例治愈 能过正常的生活 但2002 2003年他们中有2人发生了白血病 反转录病毒插入激活LMO2癌基因 反转录病毒载体插入 整合到靶细胞基因组中发挥作用 要求靶细胞是能分裂的细胞 83 腺病毒不插入靶细胞基因组 以附加体的形式存在于靶细胞中 能以不分裂的细胞为靶细胞 但腺病毒会引起人体免疫反应 84 要解决的几个主要问题 寻找更多有价值的目的基因 构建组织特异性或定向性基因表达载体 通过基因调控进行更加精确的基因治疗 优化基因治疗受体细胞的转染和移植技术 建立实用的 能确切评价体内疗效的实验模型 85 在两个方面还需要发展 把基因始终传递到病人遗传物质的准确位置的方法 消灭基因转移诱发癌症的危险 以及保证移植的基因正好受人体正常生理信号控制的能力 胰岛素就是一