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肿瘤细胞中的PTEN肿瘤抑制基因经常受到影响，可遗传的PTEN基因突变导致肿瘤敏感的情况，如错构瘤综合征。PTEN基因作为一个血浆膜脂质拮抗磷酸肌醇3-kinase/AKT细胞的存活途径。然而，PTEN基因也存在于细胞核，但机制，功能和核定的相关性仍不清楚。我们表明，细胞核PTEN基因对肿瘤抑制是至关重要的，而PTEN的进入核内是由它的单泛素化介导的。K289E与错构瘤综合征相关联的PTEN中的一个赖氨酸突变体，保留催化活性，但未能在病人组织的细胞核中积累，原因是进口缺损。我们确定这一点，另外，我们还发现这些赖氨酸残基作为泛素化的主要位点，对PTEN肿瘤抑制基因进入细胞核是必不可少的。聚泛素化导致细胞质中的PTEN降解，而核中的PTEN基因是稳定的。因此，我们确定PTEN与肿瘤相关的突变的目的是转录后修饰，并且揭示了即怎样通过区别PTEN基因的降解和自我防护这样一个离散的分子机制来控制肿瘤的演化。自从最初的肿瘤抑制器磷酸酶和染色体上的张力蛋白TEN（PTEN）张力蛋白被识别后，许多报告描述PTEN在癌标本、肿瘤细胞系、遗传综合征肿瘤细胞的衰减或突变，表明它是继p-53之后的一个最常见的影响肿瘤的抑制基因。为了更好地了解人类癌症中PTEN损失因果关系的性质，我们和其他人从遗传学的角度模拟在小鼠中PTEN的缺失造成的影响，表明，在PTEN基因缺失的患者中观察到这种动物忠实地概括了肿瘤谱。这些研究表明在上皮肿瘤PTEN基因的缺失与肿瘤的起始阶段紧密关联。最值得注意的是，我们已经证明PTEN基因的单倍不足，作为一个单一副本变得无法预防前列腺癌的损失无论是在某些其他的肿瘤抑制基因，在某种情况下或者也可以通过基因改造方法的使PTEN的表达减少或略低于杂合性。此外，最近，我们已经证明PTEN基因的完全丧失甚至会挑起p-53依赖细胞的衰老反应以拮抗前列腺肿瘤发生，这重新界定了以前假设的这两个大肿瘤抑制基因的相互作用。这一发现进一步强调了PTEN 缺失在“非Knudsonian”单命中工作模型中起着重要的作用，并阐明为什么大多数人类肿瘤中确实都保留了野生型（WT）的PTEN基因的副本。因此，了解PTEN的调节机制，控制这个”杂合肿瘤进展“是在该领域取得进展势在必行的。PTEN的催化膜的脂质第二信使PIP3转换PIP2的，因此是各种PIP3依赖原癌基因蛋白激酶拮抗剂的关键，其中主要是Akt / PKB的。紧紧连结这PTEN基因对细胞的细胞膜行动。然而，长期以来被观察到，在一些组织和培养细胞中PTEN基因是细胞核中也发现。虽然目前还不清楚什么功能可以归结为这样的PTEN基因具体而言，在核PTEN和抑制肿瘤的发展呈正相关已为黑色素瘤皮肤癌和直肠癌描述核池。但在这些相关研究，尽管迄今为在核PTEN的肿瘤抑制至关重要的作用已累计没有证据。此外，虽然这些数据表明，核PTEN基因可保留一些活动，但仍一直不清楚如何PTEN的亚细胞定位将得到规范。一般进口核蛋白质介导的独特和重要的是，转让的核定位信号（NLS）序列，例如的SV- 40的T -抗原状群集带正电荷的氨基酸。这种序列的结合赋予进口受体，它在调解核孔复合物单向或双向传输（NPCs;，见Chook和布洛贝尔然而，没有功能的NLS序列满足基本标准已发现PTEN基因，这表明PTEN基因结合到另一个免入息审查或含蛋白质被运送搭载在时尚或一完全。新的机制来规范其核进口。我们在这里描述了一个与癌症相关的突变，PTEN蛋白翻译后修饰的目标，并导致了病人的考登综合征（CS）的家人排斥的异常核型的发现。 CS是三个一常染色体显性遗传癌症密切相关综合征引起的生殖失活的PTEN基因突变和癌症的易感性是高的特点。通过识别的生物物理，生物化学，而本突变细胞生物的不足，我们在这里建立了因果关系PTEN蛋白翻译后修饰，核进口，与肿瘤的起始。1.在错构瘤患者的息肉中，细胞核排斥PTENK289之前我们已经解决了PTEN蛋白的晶体结构，揭示了一个N -端磷酸酶和C -末端C2结构域是稳定的催化结构域，是正确的PTEN基因定位于细胞膜（图1C）至关重要。而最知名的PTEN基因错义突变的目标，如催化半胱氨酸124精氨酸突变（C124R，见缩写）的磷酸酶域，一些破坏的间接影响PTEN的催化结构域的功能。然而，癌症相关错义突变也已在区域确定无明显的相关性PTEN的酶的功能或稳定性。其中最突出的是在32个氨基酸弹力内发现的C2结构域的突变，这是我们长期的C2循环。这种循环是高度保守的PTEN基因在脊椎动物，包括斑马鱼（图1A）。如前所述，在C2循环（类似N端和C端的PTEN尾巴）干扰正常晶体的形成（图1B），并能具体消化枯草杆菌，具有randomand访问从theC2框架一致凸域的构象（图1C）。重要的是，C2的循环缺乏PTEN基因保留在体外和体内野生的活动。然而，有趣的是，一错义突变的目标是循环的C2，K289E，保守残基已被描述（见图1a）。按照上述意见的协议，PTENK289E显示在膜协会的活动或无明显缺陷，如K289面临远离质膜（图1C）。因此，两者合计，C2的循环有没有积极的结构功能，其lossdoes不能侵犯onPTENactivity，和C2循环K289E突变保留其在体内酶的活性。然而，PTEN基因K289E基因被发现在一个家庭中继承，其中一个突变等位基因携带者与显示实，从而表明该基因K289E突变确实是有缺陷的肿瘤抑制。 为了探讨如何将PTEN基因突变体酶的功能可能会导致实，我们希望能学习一个家庭成员的肿瘤样本谁继承悖论 K289E突变。由于这些患者进行常规的结肠镜检查肠息肉切除，我们分析这个组织（图1D）。肠息肉有不典型增生在其表面（红色长方形，顶部）大低分化腺结构的地区，这息肉的秸秆精选也是正常结肠黏膜（绿色长方形，顶部）小面积。如前所示，这些息肉大部分失去了野生型PTEN基因突变的等位基因，同时保留，因此是只PTENK289E表达蛋白，我们希望能学习表达。正如所示，面积保留增生PTEN基因的表达（与损失相一致 野生型PTEN基因复制和展示PTENK289E稳定），但倍率透露，奇怪的是，PTEN基因是排除在上皮细胞细胞核（图1D，右 面板系列）。值得注意的是，间质细胞，它保留bothWT和K289E突变蛋白，相反还保留核PTEN的染色，染色过程为（左，右面板系列，最低面板，立法院与EP）的内部控制服务。有趣的是，在息肉的秸秆，地区正常区上皮细胞 通常都保留和WT PTEN基因突变的副本，显示强大的核和细胞质PTEN的染色（左面板系列），间质细胞非常相似， （高倍率，最低面板）。得到相同的结果时使用两种不同的抗体染色法（见实验程序）。因此，K289E突变蛋白似乎显示异常的细胞内定位，排除了核型的影子。图1。突变体显示的PTENK289E考登核排除在病人的样本 （A）序列的PTEN基因C2的循环不同物种（蓝色条）调整显示K289保护的脊椎动物（以红色突出显示）。 （B）为结晶PTEN基因裂解要求表明，C2的循环没有促进结构完整性（k为K289）。 （C）定位与PTEN的结构内（单以上骨干氨基酸代码）C2的环的大小。请注意，面临的C2循环离 细胞膜（顶部）和C2结构域（灰点）膜相互作用的循环。 （D）从PTENwt/K289E考登肠息肉患者显示核和细胞质PTEN在正常（PTENwt/K289E）黏膜（左图放大系列，绿），只有在不典型增生（PTEND/K289E）地区（右图放大系列，红）的细胞质PTENK289E。 表示立法院循环 淋巴细胞（PTENwt/K289E），而“Ep”表示上皮细胞。由于上述所示mislocalization可以是一对K289E突变或对PTENK289E息肉的具体作用的内在属性，我们分析了突变体在体外细胞内的分布。通过免疫荧光（IF）的，内源性PTEN基因是细胞核中发现和大多数常见的人类和小鼠细胞株和原小鼠细胞（未显示）细胞质中，类似在PTEN的杂合前列腺癌细胞系DU - 145显示的本地化（图2A）。要测试本地化PTEN基因PTEN的突变缺失的前列腺癌细胞（PC3上）的瞬时 转。当作为GFP融合过度，野生型PTEN基因有地平衡细胞核与细胞质之间转染后10-12小时内（图2B）。的请注意，PTEN基因的定位，催化活性的酶，死PTENC124S突变分布显示，未受影响（下左图），这表明AKT的活动（这是在PC3细胞高，仅在野生型PTEN基因转染降低）并没有明显PTEN基因定位的影响。引人注目的是，在这个时间点的PTENK289E突变体细胞质积累的优势大部分细胞，这也是通过在PTENK289E酶失去活性不受影响，C124S双突变体（图2B，右）。同样的结果，得到了非可视化的绿色荧光蛋白标记的PTEN和（图S1A，上图）相应的突变体。值得注意的是，核染色的K289E突变被发现增加转染后24和48小时（数据未显示）。由于稳态细胞质积累原则上可以通过降低进口或加强核核出口的PTENK289E结果（指示的损失或增益为功能突变，分别），接下来我们测试了PTEN基因突变的定量核和细胞质的积累率。照片荧光漂白后恢复（FRAP还原）技术生产的漂白无论是在细胞核或细胞质GFP荧光区分（但化学性质相同）细胞质和细胞核PTEN的人口。然后，房室平衡，它是通过核发生进口和出口，可以测量的时间推移荧光显微镜（见实验程序）。我们发现，野生型PTEN基因荧光reaccumulated 在细胞核内，达到了大约15分钟后核漂白（图2C）的平衡。该PTENK289E突变，相反，表明核积累明显减少，没有在同样的时间平衡。核积累率（即进口核率明显）计算发现一对K289E突变（图2d）在核净进口18倍减少。值得注意的是，动态分析表明，即使在稳态核能级ofWT和突变PTEN基因似乎是相似的（通过静态分析），突变体仍显示了对核武器的积累率大大减少。重要的是，突变蛋白表观出口率也有所下降（图2d），不包括一个增益为导出功能，通过K289E突变。这一结果也排除野生的可能性核定通过K289是由于核保留（这将导致较高的K289E出口率）。以排除具有K289E突变，K289R相关负责转换的影响突变体测结果，也显示PTEN基因导入缺陷（图S1B）。另外值得注意的是，核内和胞浆内扩散系数（衡量的FRAP还原力）的影响并不明显的突变（数据未显示，可以看到实验程序）。因此，加在一起，我们的实验显示，PTENK289E有核进口/出口的缺陷，从而代表了丢失功能的突变体，在核质穿梭缺陷。赖氨酸289是PTEN泛素化地一个主要位点鉴于其风险和可访问，我们设法确定赖氨酸289（K289）代表一PTEN蛋白泛素化网站。催化泛素化的一个E1传输激活酶，泛素（泛），以一个E2连接酶连续行动。这与一个E3连接酶演唱会，介导的泛素化的靶蛋白，通常在几个变量目标赖氨酸，从而确定一个极为重要的制度，以癌症生物学。我们已确定为主要E3的泛素连接酶的PTEN NEDD4- 1，因此测试是否NEDD4- 1在K289泛素在体外试验。我们用纯化的PTEN蛋白和赖氨酸作为基材无泛素（高山-泛素），以防止聚泛素链的形成和促进泛对PTEN的所有可用的网站，为离散波段可见西方墨点法中PTEN基因。如图3a所示（左车道，重），PTEN蛋白连接酶E2的孵化与单显示三个具体加合物，可能代表单，双和三重单泛素化的PTEN形式，而NEDD4-1加入揭示了至少七加合物中PTEN离散形式，随着NEDD4- 1作为E3连接酶的作用是一致的。在进行突变与纯化PTENK289E这个实验中，我们发现至少有一人失踪加合物乐队，强烈暗示K289 PTEN的泛素化是一个目标赖氨酸（图3A，右车道，K289E）。由于泛缺少这一系统也可由于一个突变间接的影响，我们试图确认质量K289泛直接光谱（MS）的。然而，即使是未经修改的胰蛋白酶识别片段含有残留的MS K289尝试失败，因为我们的胰蛋白酶循环片段太大，在样品制备（见实验程序）中检索。因此，我们设计的两个靶位点侧翼胰蛋白酶的C2循环K289到生产PTENRKR（图3B，顶），这是从野生型PTEN的区分有关酶的活性（见图在补充现有数据与本文线上S1C）。消费税是泛素融合PTENRKR体外，丰富和纯化通过GST下拉，经过SDS - PAGE电泳/考马斯染色，快速迁移未修改 PTENRKR（以下简称中PTEN）和第一个转移带（称为一）均离质谱分析和处理。按计划，两项预期胰蛋白酶片段的C2环（见图3B的，中间的碎片“我”和“二”）现在已经清楚的PTEN基因带分析检测，证明了乐队的主要PTEN的考马斯只包含未修改的C2的循环（图3C，看到面板上的群众和MS谱下板）。乐队的一分析，对比，揭示了更高的质量达1507.70肽，至于其他两个分支与循环甘氨酸残基肽预测，胰蛋白酶消化后剩下的泛加合物（图3C，PTEN基因，泛和图3B，最低面板）。因此，K289是一个赖氨酸PTEN的泛素化的目标，其在C2循环结构风险相一致。第二，在癌细胞中N -末端的泛素化位点发生突变和调节PTEN基因导入为了测试的泛素加合物的PTEN基因在细胞残留，样品PTEN基因表达/ PC3细胞免疫（IP）的处理，获得在场为MS，这在另一Ubadduct网站，PTEN基因K13。包括K13的肽分子量的胰蛋白酶T是在956.579大（图3d）测量鉴定结果。类似的内部C2的循环中，N端13 PTEN的残留物也非结构化和暴露，从而形成后修饰的目标。引人注目的是，PTEN的K13也发现突变为谷氨酸自发性癌症（K13E）。为了测试这是否也影响PTEN基因突变穿梭，我们分析了它的定位。正如图3e所示，PTENK13E富集在细胞质和FRAP分析，揭示了在核进口和出口缺损（图3楼，数据未显示）。值得注意的是，如图所示S1D，K13也是高度保守的。由于K13是一个带正电的集群（RNKRR），这可能为PTEN基因的功能的SV - 40型免入息审查的一部分，K13E突变可以简单地 换上了破坏谷氨酸负电荷和正电荷的基本免入息审查。因此，我们测试是否收费节约，但泛素化， 取消K13R突变仍然可以弹劾进口。另外，这种突变表现出强烈的细胞质积累由于核进口缺陷（图3E和三楼 K13R），这表明带正电荷的修补程序不PTEN的功能，而是具体的免入息审查，该赖氨酸残基的存在是必需的，符合要求一致，其泛素调节进口。我们的实验与K13E，K289E双突变发现两名赖氨酸残基可以开展合作，促进PTEN基因导入（图3楼，K13E，K289），其概念，即他们是泛目标的PTEN基因组有限的一部分显示赖氨酸（一致在图3A）。两者合计，我们已经确定了两个赖氨酸残基，由于泛素化的网站功能，是中PTEN和进口基本穿梭，并在遗传性（K289E）和自发性（K13E）癌症有牵连。图3。 K13和K289 PTEN的泛素化是主要位点 （a）在体外实验中PTEN单泛素化利用NEDD4 - 1 E3连接酶（ND4基因- 1）在野生型PTEN基因揭示几个目标地点及相应的损失至少一 目标站点（s）（“7 / 6B型”）在K289E突变（红色）。请注意，编号只反映一个真实的加合物的估计数字。星号表示非泛素特异性聚集。在kDa的分子量。 （b）（上）的地点，为工程硕士PTENRKR识别胰蛋白酶的网站。 （中）两个预期胰蛋白酶的PTENRKR C2的循环片段（I和II）。（下）预期为K289 -泛素PTENRKR（红色）片段。 （c）质谱PTENRKR和第一个加合物乐队揭示了PTEN和未修改在K289（顶部，红色）泛素PTEN基因片段的预期。下面板显示与群众的“C”表示半胱氨酸的丙烯酰胺（见实验程序）未经修改和修改PTEN基因谱。PTEN基因在体内泛素化下一步，我们问到什么程度PTEN蛋白泛素化在体内发生。而内源性PTEN基因是有效的单和多泛素化后，过度 他的标记泛，同样被发现PTEN基因过表达泛素在细胞：细胞裂解液中PTEN染色，Western blot分析显示PTEN基因的两个特定慢迁移带（图4A）表示，随着时间的推移增加（使用两种不同的抗体出现，可以看到实验程序）。此外，涂抹，看到在稍后的时间点，作为polyubiquitination预期。离散带comigrated各种形式的PTEN基因标签的共价键连接加合物作为预期（图4B，见低暴露也图S1E）。为了测试是否真的是由这些加合物进行泛成立时，我们都共同表达哥和WT泛泛 与绿色荧光蛋白PTEN基因质粒一起其次是IP地址。如图所示，PTEN和高-泛过度导致几个离散单泛素加合物，乐队被 更突出的共表达时未修改泛（图4C，左，1-3），因为该质粒（见效率和表达质粒的泛素水平的实验过程，图5c，图S1F）的性质。泛素表达也引发了多泛素化PTEN的强烈nonresolvable涂片（图4C，左，聚）。分析可见，一个- VI的PTEN的输入，离散带正好与PTEN基因的转移在模式类似上述的唯一，但揭示了额外的加合物（称为一）（图4C，右）带。因此我们的研究结果表明，类似内源性PTEN基因，PTEN基因过度表达形式单一，以及在细胞聚泛素加合物。 接下来，我们试图确定是否赖氨酸突变体表现出泛缺陷。为此，我们提出了绿色荧光蛋白，PTEN基因阁，泛素（GFP的PTEN基因-泛阁）融合蛋白（见实验程序）使用。正如四维图所示，这PTEN基因结构是目前在较低水平，由于大量的细胞泛素化（原因不明）在其退化造成的，但它似乎并没有影响整体的泛素化（右）。这个工具使我们能够通过加强研究泛直接PTEN基因PTEN的泛完全，而相比之下，泛素过表达或蛋白酶抑制，增强细胞的所有泛靶蛋白泛素化。为了检验K289和K13到泛贡献PTEN基因，细胞转染的绿色荧光蛋白PTEN基因-泛素阁，K289E和GFP - PTEN基因-泛阁- K13E突变体，分别为。如图所示（图4E条），野生型融合蛋白表现出明显的单泛素频段以及一聚泛素涂抹（注分子量），其中特有进入浓缩胶延长。值得注意的是，单Ubspecific 移（图4E条，单泛素）明显减少，同时K13和K289突变（见放大和量化图4E条，右），证实为PTEN基因在体内单泛素化的重要目标这些赖氨酸功能。请注意，强迫泛过度，相反，总是PTEN基因突变救出泛素化， 鉴于预期可能的目标站点数量（见图5c和5D条，下文）。图4。 K13和K289是泛素在体内 （a）加合物的形成表明PTEN基因在体内和在36小时posttransfection涂片（聚）。在kDa的分子量。的“N”是指一种非特异性带，星号表示未修改（单）和修改（双）PTEN的迁移。 （b）离散加合物comigrate各种PTEN基因融合。如星号（甲）。在kDa的分子量。 （c）绿色荧光蛋白PTEN基因免疫后的HA -泛素共同表达确认离散单（标1-3）和聚泛素加合物（标聚）。绿色荧光蛋白基因，PTEN的迁移显示。在kDa的分子量。 （d）低稳态水平（左），强大的泛素化（中）和PTEN特定的泛素化的绿色荧光蛋白PTEN基因-泛阁融合（右）。在kDa的分子量。 在指定的赖氨酸突变单泛素化（E）的缺陷。左边的面板上概述（浓缩胶和分子的位置标明重量），右面板显示放大和单声道泛比例量化：主要PTEN基因谱带的强度。单泛素化支配PTEN基因的核导入Ub（泛素蛋白）具有以前被认为与蛋白质运输，我们试图确定它是否会影响中PTEN的FRAP还原穿梭。泛素共表达导致PTEN的核进口的显着加速（图5A，左）。定量揭示了明显的进口率和出口率（图5A，右）“50的增长，这表明PTEN蛋白泛素化可以提高穿梭。此外，我们发现，PTEN的核分数为居民还取决于泛素表达增加（图5B，比较PTEN蛋白和PTEN +泛核分数）。 值得注意的是，核PTEN基因是不定量单泛素化，这表明PTEN基因是deubiquitinated保持核武器或其他再出口。总之，我们的结果表明，PTEN蛋白泛素化正面影响穿梭，以补充减少的泛素化和PTEN基因突变体运输的发现。为了测试是否核进口缺损的K289E突变可能被强迫泛克服，我们共同表达与泛PTENK289E和评估由如果在12小时posttransfection PTEN基因定位