原位杂交演示实验讲义.docx

原位杂交演示实验讲义一、组织标本以及器皿的处理1. 实验动物心脏灌流，一方面是除去血液中物质的干扰，另一方面可以更好的保持组织形态。2. 玻璃器皿常规洗净后 应用RNA酶抑制剂，如0.1%的DEPC水溶液，浸泡处理若干小时，然后高压灭菌除去DEPC，最后180烘烤4h。3. 载玻片预处理：常规处理步骤后，180烘烤4h，然后APES粘片。4. 冰冻切片制备。二、RNA探针制备流程1.总RNA的提取以及反转录制备cDNA：（1） 将台式离心机置于4度冰箱预冷；（2） 匀浆器头使用前后须作如下处理：a. 3 H2O2浸泡15-30min；b. 灭菌水冲洗2次，甩净，晾干；c. 匀浆；d. 匀浆后用浓度不高于0.5的SDS洗液清洗，再用灭菌水冲洗至无白沫；e. 无水乙醇浸泡，干燥，防止生锈；（3） 取1ml TIRZOL加入小试管中，同时加入组织块100mg。若组织块大于100mg，使两者比例保持为1ml ：100mg；（4） 匀浆。匀浆时应将匀浆器转速调到最大，每次转10秒钟，转多次，以防止匀浆器及其内液体过热，导致RNA降解；（5） EP管中匀浆液在室温下放置5min，4度12000g离心10min；（6） 按每1ml TRIZOL液加入0.2ml氯仿，用力振荡15s，混匀后室温放置2-3min，4度12000g离心15min；（7） 将上清液移入另一DEPC处理过的EP管中，按每1ml TRIZOL液0.5ml异丙醇的比例加异丙醇，混匀，室温放置10min；（8） 4度12000g离心10min后，去净上清；（9） 75乙醇洗涤沉淀，4度7500g离心5min，然后去掉乙醇；（10） 加适量（40ul） DEPC水或去离子甲酰胺溶RNA，用分光度计测OD260值，计算RNA含量。 RNA含量（ug/ul）OD26040稀释倍数/1000。（11）根据TaKaRa BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1试剂盒方法反应体系2Buffer 10ul25mM MgSO4 4uldNTP Mixture 1ulRnase In 0.5ulBcaBEST Polymerase 1ulOligo dT Primer 1ul（或Random Primer 1ul）（或特异的下游引物 1ul）实验样品（总RNA不大于1ug） 1ulRnase Free dH2O 1.5ul反应条件：65度1min - 30度5min -15min30min内匀速升温到65度- 65度15min - 98度5min - 5度5min2. PCR及其产物的回收：使用设计的特异引物，以总cDNA为模板进行PCR扩增。 100ul反应体系蒸馏水 66ul（66）10Buffer 10ul（10）dNTP 8ul（8）酶 1ul（1）引物-1 5ul（5%）引物-2 5ul（5）模板 5ul（5）大量扩增、电泳后，按小量胶回收试剂盒说明进行胶回收。3. PCR产物与载体的连接：根据Promega pGEMT Vector System试剂盒方法体系 10L2Buffer 5LT-Vector 1LDNA 25ng/1LH2O 2L连接酶 1L 25 1-2h4. 转化重组质粒以及重组质粒的初步鉴定：（1） 将感受态细胞从-80冰箱取出，迅速解冻放于冰水中，加入已连接质粒，轻混匀，冰上放置30min；（2） 42水浴90s；（3） 快速移入冰水中，放置30min；（4） 加4倍菌液体积的LB液体培养基，混匀，封口,37振荡培养30-60min；（5） 取300L用涂布棒均匀涂于Amp+平板上，待平板菌液干后，用封口膜封好，37倒置过夜培养14-16h；（6） 挑单菌落于10ml AMP+LB液体培养基，37 200r/min培养5-8h；（7） 菌液测序：检测插入片段有无突变以及判断插入片段的方向；（8） 使用小量质粒回收试剂盒从菌液中提取质粒；5. RNA探针标记：（1） 以质粒为模板，T7、SP6为引物进行大量扩增目的片段200L，胶回收PCR产物；（2） 根据Roche DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)，反应体系如下：cDNA x L（1g）DEPC水 13-x LBuffer 2 LT7或SP6酶 2 LNTP labeling Mixture 2 LProtector RNase inhibitor 1 L上述溶液混匀后离心 37 2h（3）2L 0.2 M EDTA (pH 8.0) 终止反应 2L LiCl 50L 100%乙醇 -20过夜。（4） 13000rpm 4 离心15min 弃上清（5） 100L 70%乙醇重悬沉淀（6） 13000rpm 4 离心10min（7） 晾干沉淀 100L DEPC水溶解 分装于-80冰箱保存。三、原位杂交实验步骤杂交前：1. 50C（展片台） 2min2. 4% PFA 1h3. PBS3 5min4. 1% Triton-100 （30ml PBS+300ml） 20min5. PBS3 5min6. 预杂交 室温 15min 预杂交液：5SSC+50%甲酰胺 (1ml: 250ul 20SSC, 500L甲酰胺，250L DEPC水)杂交液： 2mlDEPC H2O 500L10%硫酸葡聚糖 0.2g5SSC 20SSC 0.5ml50%甲酰胺(去离子甲酰胺) 1ml250g tRNA 50mg/ml 10L0.02% BSA 2% BSA 20L探针（85C变性3min, 冰上放置2min）1：100 (1ml:100ml杂交液)7. 55C 杂交 16-18 h。杂交后:8. 5SSC 50%甲酰胺(30ml: 20SSC 7.5ml, 甲酰胺15ml) 55C, 15min9. 2SSC 50%甲酰胺(30ml: 20SSC 3ml, 甲酰胺15ml) 55C, 30min10. 0.2SSC 50%甲酰胺(60ml: 20SSC 0.6ml, 甲酰胺30ml) 55C, 30min(两遍)11. 0.2SSC (30ml: 20SSC 0.3ml) 室温 5min12. Buffer1 室温 5min13. 1% Blocking (5ml: 5ml Buffer1,0.05g Blocking 37完全溶解) 室温1h14. 抗体 1：5000（1L抗体，5ml 1% Blocking） 4过夜15. Buffer1 35min16. Buffer3 5min17. 显色: NBT /BCIP。18. 甲基绿复染 照相。溶液以及试剂配制：LB液体培养基 1000ml体系 蒸馏水 1000ml 蛋白栋 10g 酵母提取液 5g NaCl 10g 摇动至完全溶解，蒸汽灭菌15-20min；若配制固体LB培养基，则在此基础上加15g/1000ul的琼脂粉之后再蒸汽灭菌。10PBS pH 7.4 100mlNaCL 1.4M 8.18gKCL 27Mm 0.20gNa2HPO4.12H2O 100Mm 3.58gKH2PO4.12H2O 18Mm 0.245g20SSC pH 7.0NaCL 150Mm 17.53g柠檬酸钠 15Mm 8.82g储备液：2.5M NaCL NaCL 14.61g 加水(普通蒸馏水，下同)至100ml0.5M MgCL2 MgCL2.6H2O 10.16g 加水至100ml1M Tris-CL(pH7.5) Tris 12.11g 加水至100ml （加HCL 约6ml，再