促排卵治疗对黄体中期子宫内膜雌、孕激素受体及其mRNA表达的影响.doc

促排卵治疗对黄体中期子宫内膜雌、孕激素受体及其mRNA表达的影响北京医科大学学报 2000年第6期第32卷 妇产科学研究作者：王颖陈咏健李美芝张小为王蔼明单位：北京大学第三医院妇产科，北京100083关键词：受体；雌激素；代谢；孕激素；代谢；排卵诱导；子宫内膜；RNA；信使；代谢；黄体期摘要目的：了解促排卵治疗对黄体中期子宫内膜雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)及其mRNA表达的影响。方法：应用光学显微镜检测着床窗口子宫内膜、采用免疫组化及原位杂交方法检测正常及多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)妇女促排卵治疗后子宫内膜黄体中期ER、PR及其mRNA的表达，放射免疫法测定同期血中雌激素(estradiol，E2) 及孕激素(progesterone，P)水平。结果：正常妇女黄体中期子宫内膜组织形态22例中有20例为分泌中期改变，2例为分泌早期改变。ER、PR弱表达，ER mRNA及PR mRNA的表达也较弱，而PCOS妇女治疗后黄体中期氯米芬9/人绒毛膜促性腺激素组及氯米芬/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素组各15例分别有8/15及7/15光镜下为分泌中期改变，其它为分泌早期改变。ER、PR的表达增强，其基因的表达也明显增强，血清P的水平相对较低。促性腺激素释放激素激动剂/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素组共10例，E2、P及P/E2接近对照组，上述标志物的表达与对照组相似。但3组PCOS分泌中期子宫内膜均有不同程度的间质增生、致密，腺体与间质发育不同步，且间质致密处ER、PR及其mRNA表达均下降。结论：氯米芬/人绒毛膜促性腺激素及氯米芬/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素方案产生了超生理水平的E2，PCOS的颗粒细胞分泌P的功能受损，P/E2水平下降，对子宫内膜ER、PR及其基因的表达抑制不利，影响胚胎的着床；而促性腺激素释放激素激动剂/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素方案则产生有利的激素环境，使分泌期E2、P及P/E2与正常对照组相似，对ER、PR及其基因表达抑制，有利于胚胎的着床。中图分类号R322.65文献标识码A文章编号1000-1530（2000）06-0503-05The effect of ovulation induction on the expression of estrogen and progesterone receptors and their mRNA in the midluteum endometriumWANG Ying,CHEN Yong-Jian,LI Mei-Zhi,ZHANG Xiao-Wei,WANG Ai-Ming(Department of Obstetric and Gynecology,Peking University Third Hospital,Beijing100083,China)ABSTRACTObjective:To study the effect of ovulation induction on the expressions of estrogen receptor,progesterone receptor and their mRNA in endometrium.Methods:Optical microscopic observation，immunnohistoche-mical and in situ hybridization techniques were used to characterize endometrial changes of the expressions of ER,PR and their mRNA in the implantation windows with 22 healthy and 40 PCOS women post ovulation inductions.Sera P and E2 of midluteal phase were measured by radioimmunol techniques.Results:In the control group，20 cases were found to be in mid-secretory phase and 2 cases in early secretory phase.ER and PR expressions varied from （）to （+），ER and PR mRNAs expressions were low.In CC/HMG/HCG and CC/HCGgroups（15 PCOSpatients each），mid-secretory phase changes were found in nearly 50%，and the remainings had early secretory phase changes.Luteal phase was characterised by P secretion deficiency，supraphysiologic estradiol levels，decrease of P/E2 ratio，and enhancement of ER，PR，ERmRNA and PRmRNA expressions.In GnRH-a/HMG/HCG group (10 cases) all the parameters and markers described above were similar to those of the control group.In all the PCOS groups,mid secretory phase of the endometrium preseat various degrees of the proliferation and density of stroma while the developments of the stroma and yands were not synchromistic.ER,PR expressions were decreased at dense stroma sites.Conclusion:CC/HCG and CC/HMG/HCG protocols induced an increase of E2 levels，a decrease in P secretion and P/E2 ratio during the secretary phase，thus affecting the endometrial receptivity.In GnRH-a/HMG/HCG protocol E2，P levels and P/E2 ratio were similar to the control group,which is beneficial to the endometrial receptivity of the embryo.KEY WORDSReceptor,estrogen/metab;Progestational hormones/metab;RNA,messenger/metab;Luteal phase;Ovulation induction;Endometrium促排卵治疗常常导致高排卵率低妊娠率，为了解这种现象的分子基础，本研究探讨促排卵药物对多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者黄体中期子宫内膜雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及其mRNA的影响，评价促排卵方案对子宫内膜的作用，为临床促排卵治疗提供理论依据。1材料与方法1.1研究对象选择我院妇产科门诊PCOS患者40例。年龄2235岁，平均28.8岁。不孕时间210年，平均4.8年。诊断标准按卫生部规划教材乐杰主编妇产科学第4版。通液或碘油造影输卵管通畅，3个月内未用任何激素类药物。对照组为同期因男性不育而就诊的月经周期正常的妇女共22例，年龄2537岁，平均27.0岁。3个月内未用任何激素类药物。1.2方法用药方案：40例PCOS患者根据就诊的时间顺序选择以下治疗方案。3组患者年龄、体重、体重指数、E2、T、A、FSH、LH间差异无显著性，P0.05。(1) 氯米芬/人绒毛膜促性腺激素(clomiphene citrite/human chorionic gonadotropin,CC /HCG):共15例，月经周期第5天(自然周期或黄体酮后撤退性出血)给予氯米芬每天100150mg共5 d;(2) 氯米芬/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素(clomephene citrite/human menopausal gonadotropin/human chorionic gonadotropin，CC/HMG/HCG):15例，月经周期第3天(同上)给予氯米芬每天100150mg共5d,第7天开始HMG 每天1支;(3) 促性腺激素释放激素激动剂/绝经期促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素(gonadotropin releasing hormone analogue/human menopausal gonadotropin/ human chorionic gonadotropin,GnRH-a/HMG/HCG):10例，由于患者的经济承受能力有限，此组病例数较少。月经周期第2天用GnRH-a每天150 g共3 d，第5天开始HMG 每天1支。当优势卵泡直径1.8 cm时,HCG500010000IU肌注诱发排卵。阴道B超监测卵泡发育： 采用Aloka-SSD630型超声仪，5.0 MHz阴道探头监测PCOS及对照组卵泡发育，确定排卵日。子宫内膜取材： 对照组及PCOS组促排卵治疗排卵后第78 天，用Pipelle管吸刮子宫前后壁，内膜组织行HE染色、免疫组化染色及原位杂交检测。内膜活检同时取周围静脉血测定E2、P。子宫内膜ER、PR的测定： 单克隆抗体免疫组化法。ER及PR单克隆抗体及SP试剂盒为美国ZYMED公司生产，以磷酸缓冲液代替抗作为阴性对照。原位杂交检测ERmRNA及PRmRNA： 探针来源:PR质粒pUC85110bp,酶切位点:BamH ,探针片段2798bp.ER质粒2867bp，酶切位点:EcoR、Hind ,探针片段1800bp.地高辛标记试剂盒由德国Boehringer公司生产，孕激素质粒由意大利Adriana Maggi博士惠赠，雌激素质粒由王蔼明博士惠赠,按试剂盒说明书操作。结果判定： 阳性染色为细胞核出现棕黄色颗粒。根据染色强度的深浅分为4级:()为不着色;(+)为淡黄色;(+)为黄色;(+)为深棕色。1.3统计分析采用成组设计多个样本比较及两两比较秩和检验进行分析。2结果2.1促排卵治疗对围着床期子宫内膜病理形态的影响(表1)本研究22例正常妇女着床期子宫内膜中20例光镜下病理为分泌中期改变； 2例为分泌早期改变。黄体功能缺陷(luteal phase deficiency,LPD)发生率为2/22。而应用促排卵方案后PCOS妇女着床窗口的子宫内膜的病理结果为CC/HCG组及CC/HMG/HCG组15例子宫内膜腺体与间质发育不同步，LPD发生率分别为8/15及7/15,与对照组相比，P0.01;GnRH-a/HMG/HCG组LPD明显下降，10例中仅有2例，发生率2/10,与正常对照组相似，P0.05。但3组中均存在不同程度的间质局灶性致密或梭形细胞增生。表1排卵后78 d对照组及PCOS各用药组子宫内膜病理结果Table 1Morphology of endometrium in controls and PCOSGroupCaseSecretoryLPDDense stromaControl222021CC/hCG157*85CC/hMG/hCG158*7*5*GnRH-a/hMG/hCG10821*P0.01，compared with control group2.2促排卵治疗对子宫内膜着床窗口ER、 PR的影响(表2、3)正常妇女着床窗口期ER、PR在子宫内膜腺上皮表达呈阴性或弱阳性，强度为()()，主要表达于细胞核上，胞浆中也可见有弱阳性表达;同时内膜间质中也可见ER、PR 的表达，强度()为主。而PCOS妇女着床窗口期ER、PR在子宫内膜腺上皮表达阳性强度以CC/HCG及CC/HMG/HCG组表达,强度为高，以()()为主，间质表达也明显增强，与对照组相比，P0.01;而GnRH-a/HMG/HCG组ER、PR无论腺上皮或间质均呈弱表达，与正常对照组相似，统计学处理差异无显著性。2.3正常妇女和促排卵治疗后PCOS子宫内膜着床窗口ERmRNA、 PRmRNA表达5例正常妇女子宫内膜ER基因(ERmRNA)阳性染色位于腺上皮，大部分位于间质细胞。其染色强度与ER蛋白染色强度及细胞分布相平行，染色强度较弱；PR基因(PRmRNA)阳性染色主要位于间质细胞浆中，呈强染色，而腺体表达几乎阴性，PR基因的阳性染色强度与PR蛋白免疫组化染色强度在间质细胞分布不平行，而在腺体细胞中大致平行。PCOS妇女促排卵治疗后GnRH-a/HMG/HCG组共5例ER、PR基因与正常对照组染色强度基本一致；而在5例CC/HCG组及5例CC/HMG/HCG组ER、PR基因的染色强度比正常对照组明显增强，尤以间质为著。而PR基因在腺上皮的表达与正常对照组相似。表2PCOS各组及对照组子宫内膜着床窗口ER的表达Table 2The expression of ER on the endometrium in the window of implantation in control and in PCOS with ovulation inductionGroupCasesGlandular cellsStroma cellsControl2299408941CC/hCG*#1515360285CC/hMG/hCG*1503571275GnRH-a/hMG/hCG1064007300* P0.05 compared with control in glandular group,# P0.05 compared with GnRH-a/HMG/HCG in glandular group.表3PCOS各组及对照组子宫内膜着床窗口PR的表达Table 3The expression of PR on the endometrium in the window of implantation in control and in PCOS with ovulation inductionGroupCasesGlandular cellsStroma cellsControl221453031450CC/hCG*#1504652256CC/hMG/hCG*#1503750474GnRH-a/hMG/hCG1073004510* P0.05 compared with control in stroma group； # P0.05 compared with GnRH-a/HMG/HCG in stroma group.2.4正常及PCOS诱导排卵周期排卵后第78天E2、P的水平(表4)正常妇女黄体中期E2、P均不高，P/E2为130/1，GnRH-a/HMG/HCG方案E2、P尽管较对照组略高，统计学检验差异无显著性，P/E2与对照组相似，P0.05；而其它方案E2、P水平明显高于对照组，但P/E2的比值较对照组明显偏低，有统计学意义,P0.01及P0.05。表4正常及PCOS各组诱导排卵周期黄体中期E2、P的水平Table 4Serum level of E2,P and P/E2 during midluteal phase in controls and PCOS with ovulation inductionControlCC/hCGCC/hMG/hCGGnRH-a/hMG/hCGc(E2）pmol*L13471571165665*1207953*782528c（P）/nmol*L143198554*5839*6829P/E2130768343*7350*12176*P0.05,*P0.01,compared with control group.3讨论3.1正常妇女黄体中期子宫内膜ER、PR及其mRNA的表达合适的E2、P、P/E2以及在其影响下ER、PR周期性的变化是刺激黄体中期子宫内膜呈可容受状态的重要调节因素1,2。子宫内膜对卵巢激素的反应质量不仅靠E2、P水平，还要看能引起子宫内膜反应的最低激素浓度及暴露时间，子宫内膜容受性取决于排卵前雌激素浓度和黄体期在孕激素中的暴露时间，这是决定内膜容受性的关键。本研究中22例正常妇女自然周期排卵后第78天P/E2为130/1，此时大部分ER、PR表达阴性，少部分为弱阳性。表明正常妇女子宫内膜ER、PR由于P分泌增高，ER、PR受P的降调节而表达减弱。ER、 PR的阳性表达主要位于子宫内膜腺体细胞、间质细胞的核内，部分也可见于腺体及间质细胞的胞浆中。与分泌中期ER蛋白表达基本平行，无论在间质细胞或腺上皮细胞，ER基因此时呈弱表达；而分泌期PR mRNA的表达则不然：子宫内膜腺体细胞PR蛋白表达量少，PR mRNA表达也同样减少；而间质细胞中PR mRNA的表达量与PR蛋白表达量不平行，PR mRNA表达多而PR蛋白合成量少，说明PR蛋白的调控可能不仅仅在转录水平，更可能有转录后的因素参与，如自分泌、旁分泌等的调控。与文献3，4报道一致。3.2不同促排卵方案对PCOS患者子宫内膜ER、PR及其mRNA的影响本研究40例PCOS患者分3组用3种不同促排卵方案，其分泌中期的子宫内膜病理形态显示CC/HCG组及CC/HMG/HCG 组中子宫内膜腺体与间质发育不同步，LPD发生率较高，分别为8/15及7/15；GnRH-a/HMG/HCG组发生率明显下降，为2/10。但3组中均有不同程度的间质局灶性致密或梭形细胞增生。应用CC/HCG或CC/HMG/HCG 促排卵黄体中期E2、P值明显增高，P/E2明显降低，由于血清P水平相对不足，对子宫内膜中ER、PR降调节不利，导致内膜ER、PR在蛋白及转录水平均表达增强。 CC/HCG或CC/HMG/HCG诱导排卵导致排卵前E2水平过度升高，这对内膜ER、PR的产生极为有利，但CC本身抗E2的作用和血中过早升高的孕激素通过降调节抑制ER及PR的产生，因而ER、PR含量是CC协同和拮抗作用的相对平衡，表现为ER、PR含量或功能异常，从而引起子宫内膜发育延迟、不足或不同步5；GnRH-a/HMG/HCG方案抑制了体内过早出现的LH峰，避免了排卵前孕酮升高所致卵泡过早黄素化，改善了卵细胞的质量，产生了有利的激素环境，E2、P接近自然周期，子宫内膜发育好，ER及PR的蛋白及转录水平与对照组相同，有利于孕卵着床。不同促排卵方案对PCOS子宫内膜分泌期着床窗口ER、PR在转录水平及翻译水平有不同程度的影响。在间质致密或梭形细胞增生处，ER、PR表达降低，对E2、P反应下降。3.3PCOS妇女促排卵治疗后的血清P水平较低的机制PCOS患者用促排卵治疗后，黄体中期E2水平在CC/HCG组及CC/HMG/HCG组明显升高，CC周期E2升高不是由于优势卵泡合成E2增多，而是其它卵泡被激活发育引起的，P相对不足。有资料显示PCOS在促排卵注射HCG当日E2、P明显高于正常对照组，但注射HCG后黄体中期，尽管E2水平仍高，P却没有相应的升高，且P不随排卵卵泡的增大而增多。认为用HCG后，PCOS卵巢黄体颗粒细胞的功能被压抑6。另有资料证明PCOS患者的黄体颗粒细胞，无论是自然周期或诱导排卵周期，分泌P的功能均受损；当用自身的卵泡液在体外培养颗粒细胞时，分泌P的功能较正常对照组明显下降，甚至消失; PCOS卵泡膜细胞在高LH作用下产生P增加，但A/P也明显增加，说明P 很快转变为A79。因此，PCOS应用CC/HCG及CC/HMG/HCG方案诱导排卵周期黄体期E2增高而P分泌未能相应升高，而应用GnRH-a/HMG/HCG由于对垂体的降调节，卵泡期及黄体期的E2水平略增高，P水平也略升高，P/E2接近于正常对照组。3.4PCOS促排卵方案的再评价随着助孕技术的发展，已经能在PCOS病人中获得较高的排卵率，但妊娠率却一直徘徊在较低水平。与妊娠率相关的两个重要因素即为胚胎质量及内膜容受性。大部分学者认为促排卵治疗损害了子宫内膜容受性。本研究中PCOS病人长期慢性无排卵，而应用促排卵治疗，CC/HCG及CC/HMG/HCG方案产生了超生理剂量的E2，分泌中期颗粒黄体合成低水平的P，P/E2明显下降，对ER、PR及其mRNA的抑制不利，可能导致了临床上常见的高排卵率、低妊娠率的结果。外源性孕激素支持黄体可望改善低P、低P/E2的状态，对PCOS的妊娠率有所改善。GnRH-a/HMG/HCG在本研究中被认为是一种良好的促排卵方案，产生了比较好的激素环境，为胚胎的着床提供了良好的基础条件。参考文献1，Garcia E,Bouchard P,de Brux J,et al.Use of immunocytochemistry of progesterone and estrogen receptors for endometrial dating.J Clin Endocrinol Metab,1988,67:80-872，Lessey BA,Allen PK,Deborah AM,et al.Immunohistochemical analysis of human uterine estrogen and progesterone receptors throughout the menstrual cycle.J