Westernblot实验技术讲义抗体大王分享

Westernblot实验技术 巴傲得生物上海分公司金永红4006609091king 定义 印迹法 blotting 是指将样品转移到固相载体上 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法 WesternBlot是分子生物学 生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法 1975年 Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 NC膜 上 并利用DNA RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 称为Southern印迹法 而后人们用类似的方法 对RNA和蛋白质进行印迹分析 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 WesternBlot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体 然后用这种多肽的特异抗体来检测 WesternBlot基本原理 WesternBlot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 被检测物是蛋白质 探针 是抗体 显色 用标记的二抗 经过PAGE分离的蛋白质样品 转移到固相载体 例如硝酸纤维素薄膜 上 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免疫反应 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 WesternBlot一般流程 蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜封闭一抗杂交洗涤二抗杂交洗涤底物显色 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水 稀盐 稀酸或碱溶液中的蛋白质 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好 溶解度大 是提取蛋白质最常用的溶剂 细胞裂解液 0 5ml水 0 5ml裂解液 10 l蛋白酶抑制剂 10 l泛酸钠 1 lpepstain有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取 包括乙醇 丙酮和丁醇等 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的制备 细胞数量达5 106个时就可以做WB 将细胞裂解液在离心 收集上清液 加loading煮样5min 蛋白样品制备的注意事项 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 SDS是一种离子性的界面活性剂 它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链 当SDS与蛋白质混合时 它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来 而以硫酸根离子外露与水分子作用 大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1 1 4 以重量为单位 而蛋白质和SDS结合后 由于SDS带强负价 使蛋白质原先的带电价微不足道 且每单位重量的蛋白质带电价一致 chargedensity 所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 纯净水丙烯酰胺和N N 亚甲双丙烯酰胺 SDSTris HCLTEMED过硫酸铵 凝胶成份 凝胶浓度与蛋白分离范围 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项 做胶 防止漏胶 进气泡以及花胶 水封 插梳子和拔梳子 加样 两边加loading 加样量一样 加样时间要尽量短 以免样品扩散电泳 将胶夹好放于电泳槽中 加电泳buffer 内外面不能联通 将电压调到85V开始电泳 待marker出现6条带时将电压调到135V 直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳 转膜 半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间 电转10 30min 湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间 浸泡在转移装置的缓冲液中 电转45min或过夜 转膜注意事项 泡膜 转膜之前将海绵 胶 膜都用转移buffer浸泡20min转膜顺序 阴极碳板 海绵 三滤 胶 膜 三滤 海绵 阳极碳板转膜 0 35A250V1h40min 封闭 1h 封闭时间过短会导致背景过深 5 脱脂奶粉 如果用生物素标记的二抗 就不能用奶粉封闭 因为奶粉中含有生物素 BSAWesternBlot膜封闭液 生物试剂公司提供 剪膜 一抗 二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中 根据滤膜面积以0 1ml cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育 抗体浓度过高会导致背景较深 过低会导致和抗原结合不充分 出现假阴性 室温不少于7小时 4 时过夜 回收一抗溶液 用TBST洗膜3次 每次5min 洗涤不充分会导致膜上非特异性条带处仍有一抗残留 会影响二抗结合的位置不准确 加入二抗溶液 摇床上缓慢摇动 室温避光1 5 2h回收二抗 TBST洗膜3次 每次5min 纯净水洗膜5min 显色反应 重组蛋白一般用磷酸酯酶AP显色或是二氨基联苯胺DAB显色 裂解液一般用发光法 辣根过氧化物酶HRP标记二抗用DAB显色 按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中 避光混匀 将膜加入显色液中避光显色5 15min终止反应 对照Marker记录实验结果 将印迹膜晾干扫描保存底物发光法 将两种显色底物1 1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀 用玻璃胶片把膜包起来 马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面 时间根据光的亮度来衡量 显影 定影 注意 发光法检测的时候曝光时间要恰到好处 过短会导致曝光不彻底 影响条带亮度 过长会导致荧光信号衰弱 也会使背景颜色加深 化学发光 显影 定影 1 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合 1min后 将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触 1min后 将膜移至另一保鲜膜上 去尽残液 包好 放入X 光片夹中 2 在暗室中 将1 显影液和定影液分别到入塑料盘中 在红灯下取出X 光片 用切纸刀剪裁适当大小 比膜的长和宽均需大1cm 打开X 光片夹 把X 光片放在膜上 一旦放上 便不能移动 关上X 光片夹 开始计时 根据信号的强弱适当调整曝光时间 一般为1min或5min 也可选择不同时间多次压片 以达最佳效果 曝光完成后 打开X 光片夹 取出X 光片 迅速浸入显影液中显影 待出现明显条带后 即刻终止显影 显影时间一般为1 2min 20 25 温度过低时 低于16 需适当延长显影时间 显影结束后 马上把X 光片浸入定影液中 定影时间一般为5 10min 以胶片透明为止 用自来水冲去残留的定影液后 室温下晾干 应注意的是 显影和定影需移动胶片时 尽量拿胶片一角 手指甲不要划伤胶片 否则会对结果产生影响 凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照 用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值 WesternBlot常见问题分析 SDS PAGE电泳 胶不平 凝胶漏液 胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀 使其充分混合 防止部分胶块聚合不均匀温度合适 受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐 条带比正常的窄 微笑 或 倒微笑 条带 凝胶聚合不均匀 灌胶时候尽量混合均匀 动作轻缓拔梳子要迅速 且竖直的拔样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一 纯化样品 调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果 应赶走气泡 同时注意电泳槽装置是否合适 转膜