蜜蜂性别决定机理研究.doc

蜜蜂性别决定机理研究作者：摘要：叙述了4 个蜜蜂性别决定机理的假说：即性位点假说、基因平衡假说、蜜蜂性别决定综合假说和性基因数量决定假说。然后详细介绍了性别决定互补因子理论，并提出了我们课题组对蜜蜂性别决定机理的一些想法。关键词：蜜蜂 性别 csd人类的性别是由X、Y性染色体来决定，有两条X染色体的是女性，男性则各有一条X、Y染色体。而像蜜蜂这种群居性的膜翅目动物，其性别决定基因就没这么简单了。由于蜜蜂生产大量蜂蜜，一旦蜜蜂遭受环境污染物的影响，便可能大幅影响人类的农业经济，因此蜜蜂基因组的定序计画被视为重要的研究。蜜蜂性别决定与性比调控机理研究更有助于揭示蜜蜂王国中的许多秘密，从而获得人工控制蜜蜂性别和调控性比的主动权，因此无论在理论上，还是在实践上都有重要意义。国内外许多学者从不同角度对蜜蜂性别决定与性比调控机理进行了卓有成效的研究.一、对4种学说的回顾:性位点假说、基因平衡假说、蜜蜂性别决定综合假说和性基因数量决定假说。人类对蜜蜂的利用历史至少可以追溯到公元前7 000 年，但对蜜蜂性别的认识却只是近400 多年来的事情。1586 年Torres 指出蜂王是雌性蜂，1609 年Butter 指出雄蜂是雄性蜂，1637年Remnant 进一步指出蜂群中的工蜂都是雌性蜂。1737 年Swarmmerdan 首次通过解剖证实了蜂王、工蜂和雄蜂的性别。至此蜂群中的三型蜂（蜂王、工蜂及雄蜂）的性别已基本清楚。接下来的问题是：蜜蜂的性别是如何决定的？1845 年Dzierzon 提出了著名的蜜蜂性别决定理论雄蜂是由未受精卵发育而成的，而蜂王和工蜂则是由受精卵产生的。Dzierzon 认为：蜂王可以“随意”地产下受精卵和未受精卵。这样蜂王可以通过产卵来控制后代的性别。Dzierzon这个几乎完美的蜜蜂性别决定理论对养蜂业发展起了很大推动作用，但也遇到了以下研究结果的挑战。1892 年Hewitt 发现未受精迦太基工蜂可以产生蜂王和雄蜂，1912 年Onions 也在南非的海角蜂中发现类似的孤雌生殖现象。随后在欧洲品种的蜜蜂、东方蜜蜂中也发现工蜂生殖现象。另外，1957 年Rothenbuhier 发现由受精卵发育而成的二倍体雄蜂的存在，Woyke 证实二倍体雄蜂不是由于生理缺陷死亡，而是在幼虫期被工蜂吃掉，并设计实验成功地培育出大量的二倍体雄蜂。显然Dzierzon 理论无法解释以上现象，这给蜜蜂性别决定理论又罩上了一层神秘的面纱。正是由于人类的好奇心，促使许多人去潜心研究蜜蜂性别决定机理，并提出许多种关于蜜蜂性别决定机理的假说。这里我们先来回顾其中几种比较有代表意义的蜜蜂性别决定假说。1、性位点假说1943 年遗传学家Whiting 在研究麦蛾茧蜂时，发现一个与性别决定有关的遗传位点（X 位点），在这个位点上的基因为复等位基因（Xa，Xb，Xc）。当X 位点上的一对基因纯合时发育雄性蜂，当这一位点上的基因杂合时则发育成雌性蜂（图1）。而未受精卵是单倍体。在X 位点上就相当于是纯合，所以发育成雄蜂。1951 年Mackensen 通过实验证明了蜜蜂中存在像茧蜂性位点假说同样结果。1995 年Huntt 和Page 应用随机扩增多态DNA 标记建立了染色体与性决定位点的联系。这一假说可以成功地解释二倍体雄蜂存在的现象，但不能解释蜜蜂孤雌生殖的原因。2、基因平衡假说1957 年Cunha 和Kerr 提出了有关膜翅目性别决定的基因平衡假说。其主体内容为：性别是由一系列雄性基因m 和一系列雌性基因f来决定。m 没有累加效应，因此半合子m 与纯合子mm 的m 效应是相同的，二者均设为M。由于f 有累加效应，所以半合子f 为F，纯合子ff为2F。然后性别由关系式2F M F 决定。这样在单倍体个体中M F，所以是雄性在二倍体个体中2F M，所以是雌性。1975 年Chaud 和Netto 对基因平衡假说进行了补充修改：m 基因具有微小的累加效应。这样单倍体雄蜂为m1 + m2 X1 + f，二倍体雄蜂为2m1 + 2m2 X1X2 + ff，二倍体雌性蜂为X1X2 +ff 2m1 + 2m2。其中X 等位基因解释为当纯合时具有丢失累加效应的主要雌性决定基因，而其杂合时，则具有累加效应。1993 年Cook 指出这个假说适应整个膜翅目。但本假说无法解释为什么决定雄性基因m 无累加效应或仅具有微小的累加效应，而决定雌性基因f 有累加效应。3、蜜蜂性别决定假说1983 年张宗炳提出了一个蜜蜂性别决定综合新假说。首先假定除了（1）雄性决定因素（m1，m2）；（2）雌性决定因素（有2 个位点，即至少有2 对等位基因，Xa1Xb1）之外；还有（3）第3个基因，即雄性因素的表达控制基因。若这一基因存在，雄性因素有2 对雌性基因为纯合时，则表现为雄性；若这一基因不存在，尽管2 对雌性基因都为纯合，但仍然发育为二倍体纯合子雌蜂。这一假说解释了纯合子二倍体雌性蜂产生的可能性。4、性基因数量决定假说1991 年李有泉和王海蓉在研究现有蜜蜂性别决定假说的基础上，提出了性基因数量决定假说，其主要内容为：X 单倍体性型蜜蜂的性别决定，是在性型的结构形式和性基因的数量双重机制作用下实现的。它们的性型结构属开放型，X 单倍体的结构式为A-X，XX 二倍体结构式为A-X = X-A（其中A 代表常染色体组）。在XX 二倍体的X 染色体之间有“性结合键”直接相联，因此X 染色体上X 基因（决定雌性）有相加作用（X 基因相加有效数量总和记为X总）。而常染色体组之间无“性结合键”，因此常染色体组合的Y 基因（决定雄性）无相加作用（Y 基因由于无相加作用，Y 基因有效数量总和仍然为Y）。X 染色体含X 基因的数量小于常染色体组含Y 基因的数量。因此在单倍体中，由于X总 Y 时，发育为二倍体雌性蜂；当X总= Y 时，发育为二倍体中性蜂（雌雄嵌合体）；当X总 Y时，发育为二倍体雄蜂。本假说从理论上提出用“性结合键”解释了决定雌雄基因有无相加作用，但“性结合键”是否真正存在，还有待于进一步探讨由此可见，以上提出的4个假说各有千秋，但没有哪个假说可以完完全全正确的解释对于蜜蜂性别的决定。而在下文中，一种新的解说可以更好的解释这一现象。二、性别决定互补因子（complementary sex determiner, csd）理论德国马丁路德大学的Martin Beye、Martin Hasselmann和美国加州大学戴维斯分校的昆虫学家Robert Page、Kim Fondrk等人，在8月22日出版的细胞期刊中指出，他们找到了称做性别决定互补因子（complementary sex determiner, csd）的蜜蜂基因，这个基因包含有19个对偶基因。研究者发现，雌峰的这两个csd基因复本，分别来自父亲与母亲，两个复本会合力制造出一种具有活性的蛋白质，能够诱使受精卵发育成雌性；而未受精的蜂卵只含有来自母亲的csd，缺乏有活性的蛋白质，因此长成雄蜂。研究人员针对csd的四种对偶基因序列进行研究，发现它们之间有很大的差别。此外科学家也发现，同一个对偶基因可以在雄蜂和雌峰体内都出现，表示并没有特定的对偶基因是雄性独有或雌性独有，而是csd复本数目才能决定性别。科学家发现，蜂卵产下后的12个小时，csd基因会开始活化，并在发育过程中持续表现。如果研究人员用RNA干扰方法抑制csd基因的活性，雌性卵就会长成雄蜂，而相同的方法用于雄卵则不会产生任何效果。在正常状况下，一只女王蜂可以跟好几只雄蜂交配，以使得后代有多样的csd基因组合。不过，有时候雌性难以找到性伴侣，她会先产下一只雄蜂，然后再和它交配，可是近亲交配的结果，使得雌蜂与跟她有相同csd基因复本的雄蜂交配，而产下没有生育力的雄蜂，结果工蜂就会把这些没有生育力的雄蜂杀死。蜜蜂种群内不但存在着互补性性别决定基因csd，而且可以被从蜜蜂体内成功分离。现已发现19个复等位基因(csdl，csd2csdl9)，任意2个不同的等位基因，可以共同编码并产生一种有活性的精氨酸一丝氨酸丰富的蛋白(SR蛋白)；任意2个相同的等位基因或仅仅1个等位基因，不能指令形成这种SR蛋白。于是，能形成这种蛋白的，雌性发育得到准许；不能形成这种蛋白的，雄性发育被认可。也就是说，同一个等位基因既可以在雄蜂体内出现，也可以在雌蜂体内出现，并没有特定的雄性基因或雌性基因，而是一个个的雌雄共享基因，通过单双组合形式调控性别发育和促进雌性等级的进一步分化。运用RNA干扰技术，也证明了蜜蜂确实不存在着具有性别特异性的性基因，但存在着性等位基因数目决定蜜蜂性别的机制，同时还很好地解释了为什么称csd为性别决定互补因子的原因。在自然状态下，蜂群中的某一父系的后代，由于基因型组成的关系，可以被优先选来培育成蜂王，可以率先成为无王群中的产卵工蜂，并形成更紧密的超姐妹小团体，在偏袒性养育超姐妹的雄性后代中，共同躲避工蜂警察，同时得到间接的适合度，直接延续父皇家族基因的血脉，甚至孤雌生殖产生杂合子雌性(海角蜜蜂Apis mellifera capensis)。像母子交配或兄妹交配等这样的近亲交配，一方面使得csd位点上纯合产生的二倍体雄性带有零适合度。在幼虫早期就遭到蜂群的淘汰；但另一方面也使得csd位点上杂合产生的二倍体雌性，完全继承了母系的纯正血统。当蜂群结构突然变故，如失去蜂王时，这些具有纯正皇室血统的受精卵、适龄雌性小幼虫或成年工蜂，就比蜂群中其它成员拥有优先的性发育权。也就是说，在这个刚刚无蜂王的超家族中，某一父系(与蜂王的一个性位点基因相同)的后代，被优先确立为蜂王级型或优先发育成有生殖能力的个体(产卵工蜂)。在配子发生过程中，每个单倍体核里都有1个等位基因csd。当行两性生殖时，来自双亲的2个单倍体核里的2个等位基因，是异质的融合就产生雌性，是同质的融合就产生雄性。当行孤雌生殖时，结果亦如上述，但卵子和第1极体的融合是同质的纯合子(性等位基因一样)，卵子和第2极体的融合是异质的杂合子(性等位基因不一样)，卵子不和极体融合相当于是同质的半合子。所以，海角蜜蜂的产卵工蜂孤雌生殖能够产生杂合子雌性，则其它种蜜蜂的产卵工蜂孤雌生殖或许能够产生纯合子雄性，这只不过是个被发现的时问而已。养蜂业时常会以近亲繁殖的方法提高蜜蜂产量，可是这样会造成许多不孕的后代，代价实在太高了，因此科学家这次找出决定蜜蜂性别的基因，不但是科学上的一大突破，对养蜂业者而言也是一大福音。图一 CSD的基因位置(A)重组体基因图谱和覆盖有染色体步移的性别基因座区域EcoRI酶限制的图谱Q标记着步移的开始, 基因组DNA的持续不断的牵张由局部基因表达库组成,在一些情况下,由基因步移的工具盒碎片组成.各个克隆的长度和限制图谱由限制性酶切谱决定,克隆间的重叠区由杂交试验和使用针对克隆体末端的特殊引物的PCR分析来推断. 科学家(Beye et al., 1999)对克隆样品进行了测试以确定它在性别决定区的物理图谱中的正确位置,嵌合的克隆排除在分析之外.在性别决定基因座上杂合的雌性的重组体图谱位于标记MKFHi-52的性别决定基因之后. 在1000个雌性中,没有发现在下一个标记GWQFMb更末端的重组体.这表明了性别决定的基因座至少部分位于这两个标记之间,这一估计的精确度在5kb/2.5kb之间(95%的置信区间). 没有更末端的基因由于各种各样的方法被独立. 对一个24kb长的包含标记GWQFMb和MKFHi-52进行鸟枪法测序, 再使用STADEN PACKAGE软件进行组合. (B)外显子(绿色)由RUMMAGE中各种各样的算法MZEF, Grail, Xpound, Genscan, 和 Fgene和Gene Machine公司的使用人类或果蝇这样的模式生物来预测外显子的注释软件预测得. 局部序列排比检索找到了一处与各种昆虫的mariner氨基酸序列相似(用黄色显示)(C) 被预测得外显子在胚胎早期形成了转录物. RT-PCR(红色的矩形)显示了这些外显子属于两个转录物.(D) 由不同的cDNA的克隆和对其5/3末端进行的快速扩增实验建立的CSD以及Ex4.85.8的转录子的基因结构. CSD转录子位于不存在重组体的标记GWQFMb和MKFHi-52之间. 最后的分析显示了MKFHi-52是靠近CSD的3端的748bp的开始,而GWQFMb包含了CSD的第一个外显子. CSD由9个跨越了9279个BP的基因基因序列外显子组成,包括在第5,6个外显子之间的一段MARINER序列. 第二个Ex4.85.8的转录子的3末端位于距标记GF3FMHi的开始序列1586个BP的近端(距CSD大约0.4厘米). Ex4.85.8的核苷酸序列长约598个BP,由两个跨越1446个BP的基因序列的外显子组成. Ex4.85.8的核苷酸序列长约598个BP,由两个跨越1446个BP的基因序列的外显子组成. 注意,我们不能排除Ex4.85.8的5末端没有被完全获得的可能性因为没有5的未翻译区域在假定的开放解读码组中被检测到.图二 群落表型,性别,近亲杂交动物的基因型.性别以及在近亲杂交中的性别决定等位基因的基因型. 一半的受精卵在性别决定基因座上是纯合的,发育成了被工蜂吃掉的二倍体雄性. 杂合体发育成用于基因定位的雌性. 半合子来源于未受精的卵,发育成雄性近亲交配导致的群落表型. 二倍体雄性的幼虫在他们孵化后不久就被工蜂吃掉,留下了孵化所中那些空的蜂巢. 这种情况被称为“尽巢”. 右边的图片显示了一个不产生二倍体雄性的群落的孵化所. 来源于未受精的卵的雄性被放在独立的孵化所和蜂巢里,在这里没有显示出来.图三 CSD的CDNA的序列以及CSD蛋白质的序列比照结果(A)通过分析CDNA以及基因区域确定了复合式序列以及外显子的边界通过对至少3个CDNA的克隆以及对5到3的快速扩增得的碎片进行测序找出了这长达1453个BP的共有序列. 这段共有的序列(即组装起来的碎片)编码了一个385个氨基酸的蛋白质. 一些后续的分析者发现一些存在于5到3的未翻译区域以及蛋白质编码区域的多态性符合于同一CSD转录体的不同等位基因. 然而在这些实验中,这段共有序列仍然提供了来源于不同的CDNA的最丰富的核苷酸序列. 在外显子3中,一种罕见的CSD备择结合方式存在,最初的十一种氨基酸的缺失与此相关. 科学家克隆相同的CSD等位基因确定了这种罕见的结合方式,并且通过基因组分析验证了它. 重复的精氨酸(R)与丝氨酸(S)位于羧基端的末尾(在第228个和317个氨基酸之间),这与果蝇中各种同样的蛋白质的域同源. 值得注意的是R,S蛋白质由不同的外显子生成. 一个富含脯氨酸的区域位于在氨基酸324和383之间的羧基端.(B)CSD与TRA结构上的相似CSD的成对对比的示例(223到382的序列从图3A中得到)和TRA蛋白序列. 黑体的基表明多态的氨基酸和箭头标记插入(标记了插入的氨基酸的数量),插入的CSD序列在图五中显示. 红色的矩形显示了重复出现的精氨酸(R)与丝氨酸(S)的域.蓝色的矩形强调了在CSD和TRA序列中非常常见的羧基端的富含脯氨酸的区域,这表明了正是连续的RS蛋白以及富含脯氨酸区域导致了相似性. 绿色的矩形显示了一个包括11个氨基酸的区域在种Drosophila, D. hydei (Dh), D. erecta (De), D. simulans (Ds), D. virilis (Dv), D. melanogaster (Dm), 和 Ceratitis capitata中高度保守. 在这个矩形中的绿色,黄色,白色的条形分别表明了在6/6,5/6和少于4/6的大多数蛋白质间的氨基酸特性. 值得注意的是.这个非常保守的序列在CSD中不存在. 由成对的对比推理出整个ORF的以及RS和脯氨酸富含区域的序列特性.这一分析包括了D. melanogaster, 由virilis/hydei 复合而成的D. virilis ,C. ceratitis的TRA序列以及图三中的CSD序列.在图3B中定义的保守的TRA特定域(绿色矩形显示)之后RS域及脯氨酸富含区域的序列的比较和对比已给出.图4 CSD的转录谱和基因组机构的单独的基因组织(A)使用CSD的CDNA做探针对来自发育0到30个小时的旧雌性卵的全部RNA进行rna印迹分析. 发现了一种大约1500碱基的单独的转录物. (B)使用CDNA-PCR技术得出的在两个性别之间贯穿整个发育过程的转录时相的示例. 过了12个小时(早期胚盘)以后,CSD转录物出现在了在雌性和雄性的卵(12到72小时),幼虫(L4)和蛹(在孵化之前3天)中. 这被扩增的长400BP的CSD碎片包含了外显子4-7. 在两个性别之间并且贯穿整个发育过程,包含全部ORF在内的其他引物组合产生了相同的转录时相(数据未标出). 一个长达700BP的延长因子的碎片1(EF-1)在两性之间及整个发育过程中的转录中起到正控制的作用. 负控制的因子没有被扩增(数据未显示). 通过Southern印迹(DNA印迹)杂交分析得出的蜜蜂基因组中CSD的复制数目. 为减少在Southern印迹分析中观察到等位基因限制的多态性的可能性,使用了近亲交配的动物的DNA,并且限制酶被选用来使印迹处于呈现高度核苷酸多态性的编码区外. 被发现的条带符合于由CSD的基因组序列预测的限制性位点. SCA1被预测在外显子3和4之间切开,并且CSD5末端之后的5个KB符合于被观测到的12KB长的条带. 每个Pst1区都被预测侧接于符合在杂交试验中被发现的15KB长条带的的CSD编码区(CSD3末端之后2109个BP,以及5末端之前3032BP).图五 CSD等位基因导出的的氨基酸序列的排列绿色,黄色,灰色的矩形分别表明了在全部,3/4,以及一半的顺序等位CSD多肽中的胺基酸序列相同度. 破折号用来表示为最大化等位基因同源性引入的缺失染色体.等位基因CSD C与CSD A从“同源十字”(见实验手册)中被分隔开而CSD b14 和CSD d118均从自然群落中获得. 注意红色的矩形表明RS域,蓝色的矩形标志了脯氨酸富有区域.表格一 在对具有两性基因的胚胎进行的CSD抑制的分析中的CSD基因型和性腺发育性腺发育卵CSD基因型csd dsRNANon-csd dsRNA控制组雌性csdG/csdH 或者 csdG/csdI36个睾丸,3个卵巢33个卵巢23个卵巢雄性csdH 或者 csdJ21个睾丸ND22个睾丸基因雌性(来源于受精卵)和基因雄性(来源于未受精卵)的胚胎被注入了900pg的双链RNA,控制组未被注入. 解剖幼虫以确定性腺的发育情况. 只有完整的睾丸和卵巢的发育在这个实验中被记录. 杂交的CSD等位基因的外显子6-9的基因序列被确定. 这一序列被用来预测能在杂合子中区别CSD等位基因的限制性位点,.动物的CSD等位基因基因型由根据这些限制性位点,进行的CAPS分析确定. 基因型的分析表明全部的基因雌性是在CSD上是杂合的,然而基因雄性显示了两种半合的CSD基因型.ND,不确定.三、评述性位点假说研究了性别决定有关的遗传位点（X 位点）是纯合发育还