超声波辅助提取砂糖桔皮多糖的优化工艺-正文.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除 毕业论文题 目（中文）： 超声波辅助提取砂糖桔皮多糖的优化工艺 （英文）： Optimization on Extraction Technology of Shatangju Citrus Peel Polysaccharides by Ultrasonic Assistant Method 姓 名: 学 号: 院 （系）: 生命科学与化学工程系 专业、年级: 食品质量与安全 指导教师: 目 录摘 要IAbstractII第1章 绪论11.1砂糖桔的简介11.2植物多糖11.2.1多糖11.2.2植物多糖11.2.3砂糖桔皮多糖的用途21.2.4多糖的生理活性及应用研究21.3国内外关于多糖的提取研究现状31.3.1溶剂提取法41.3.2超声波辅助提取法51.3.3 微波辅助提取法51.3.4 酶解法61.3.5 超临界萃取法61.4研究的目的和实际意义6第2章 材料和方法82.1原料和试剂82.1.1原料82.1.2试剂82.2仪器和设备82.3实验方法92.3.1制作工艺流程92.3.2实验研究92.3.3绘制葡萄糖标准溶液工作曲线92.3.4砂糖桔皮粗多糖的提取102.3.5砂糖桔皮水溶性多糖精制102.3.6砂糖桔皮多糖提取的单因素试验102.3.7正交试验112.3.8砂糖桔皮水溶性精多糖含量的测定112.3.9砂糖桔皮多糖提取的稳定性实验12第3章 结果和分析133.1葡萄糖标准溶液工作曲线图133.2砂糖桔皮粒度大小对砂糖桔皮多糖提取率的影响133.3超声波提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响143.4料液比对砂糖桔皮多糖提取率的影响153.5提取温度对砂糖桔皮多糖提取率的影响153.6提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响163.7砂糖桔皮多糖提取正交实验163.8最佳条件下精制多糖的提取率18第4章 结论与讨论194.1砂糖桔皮水溶性多糖的最佳提取条件及提取率194.2本论文的优缺点19参考文献21致 谢23精品文档超声波辅助提取砂糖桔皮多糖的优化工艺摘 要本文以水为提取溶剂，超声波辅助处理砂糖桔皮，研究了提取砂糖桔皮水溶性多糖的优化工艺。采用单因素试验法探索了超声波处理时间、砂糖桔皮粒度、料液比、提取时间和浸提温度各因素对砂糖桔皮多糖提取率的影响，确定各因素的水平，通过正交试验法确定了最佳提取工艺条件：提取温度 (T) 为70、料液比(m/V)为1:30、提取时间(t2)为2.5h、超声波处理时间(t1)为3min。此条件下砂糖桔皮中水溶性多糖的含量为5.255%，此研究为大规模提取砂糖桔皮多糖提供了依据。【关键词】超声波辅助；砂糖桔皮；多糖；提取Optimization on extraction technology of shatangju citrus peel polysaccharides by ultrasonic assistant methodAbstractIn this paper,the optimization extraction of water-soluble polysaccharides from shatangju citrus peel was studied and the water was used as extracted solvent, ultrasonic assistant as method. The effect of major factors on the extraction was investigated by single-factor test, it includes: ultrasonic-extraction time, granularity of shatangju citrus peel, material-water ratio, extraction time and temperature. The optimization was confirmed by the orthogonal experiments with the obtained levels:70 as extraction temperature,1:30 as material-water ratio,2.5h as extraction time, and 3min as ultrasonic-extraction time. The yield is 5.255% under the optimum extraction condition,this research provided a basis for massive extraction of shatangju citrus peels.【Key words】Ultrasonic-assistant; Shatangju citrus peel; Polysaccharides; Extraction第1章 绪论1.1砂糖桔的简介 砂糖桔(Citrus shatangju)芸香科，柑桔属，是柑桔的一个优良品种，本草纲目记载“桔，甘者润肺，酸者聚痰，止消渴、开胃、除胸中隔气”。砂糖桔又称沙糖桔、冰糖桔、十月桔、蜜桔，原产广东四会。果实扁圆形，顶部有瘤状突起，蒂脐端凹陷，色泽橙黄，囊壁薄，易剥离，果肉爽脆、汁多、化渣、味清甜，吃后沁心润喉，耐人寻味。砂糖桔果实含可溶性固形物11%，每100毫升含全糖10.55克，果酸0.35克， 1克砂糖桔能产生1.4卡热量，矿质元素铁、锌、铜及维生素C和D的含量都很高1。除此之外，果实全身是宝，其皮、肉、络、核等都是正统中药，有理气健胃、止咳平喘的作用；富含的果胶能降血压，橙皮甙和芦丁具有强化血管壁，提高毛细血管抵抗能力的作用，从而可以防治高血压和动脉硬化等成人病；果实中含有的类柠檬素、类黄酮、类胡萝卜素等各种抗癌活性物质，对胃肠癌、肺癌、皮肤癌等多种癌症有良好的防治作用，而且砂糖桔果实对预防成人肥胖症和糖尿病也有一定作用。1.2植物多糖1.2.1多糖 多糖(polysaccharide)是由单糖分子或其衍生物缩合而成的高聚物，是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，它是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子，能参与机体各种生理代谢，具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖血脂、抗辐射、抗菌抗病毒等生物活性，故其独特活性和来源的天然性在保障人体健康应用中具有强大潜力2。多糖除具有免疫调节、抗肿瘤的生物学效应外，还具备抗衰老、降血糖、抗菌抗炎、抗辐射、抗病毒、降血脂、抗凝血及清除体内外氧自由基等作用，且对机体毒副作用小，故在保障人体健康应用中具有强大潜力3。1.2.2植物多糖 植物多糖是一类重要的天然活性物质，其最大优点是毒副作用小，来源广泛，在植物、动物和微生物内均有存在，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等，是自然界含量最丰富的生物聚合物。我国对多糖研究始于20世纪70年代，植物多糖由于它们独特的功能和低毒性，在新药发展的方向具有广阔的应用前景，目前我国已上市了不少多糖类药物，且正在吸引着越来越多研究人员的目光。1.2.3砂糖桔皮多糖的用途砂糖桔多糖属植物多糖中的一种，可用在医药治疗、保健品研制、美容护肤方面，还可用在食品工业、乳化剂、稳定剂及果蔬涂膜等方面。1.2.4多糖的生理活性及应用研究 (1)免疫调节、抗肿瘤作用 多糖的免疫调节作用主要是通过激活巨噬细胞、淋巴T和淋巴B细胞、网状内皮系统、补体，促进干扰素、细胞因子、白细胞介素生成来完成的。香菇、黄芪、云芝、冬虫夏草、猪苓、刺五加等多糖均具有免疫调节的功能4。很多植物多糖能够抑制或杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞，具有激活免疫细胞、抑制肿瘤生长、改善机体免疫功能的作用，而免疫功能的提高是机体抗肿瘤能力的主要机制之一。文蛤糖蛋白100、200g/g 能显著抑制S180的生长，提高EAC腹水癌小鼠的存活时间，其抗肿瘤活性与免疫活性密切相关。Sogawa等从海洋微藻Dinoflagellategymnodiniumsp.A3中分离的多糖，体外10g/L浓度能全部抑制白血病K562细胞的端粒酶活性5。从黑斑海兔（Aplysia Kurodai）卵中分离的一种糖蛋白，具有极强的抗菌作用，0.4g/L就能抑制大肠杆菌的生长，0.13g/L 抑制金黄色葡萄球菌、Klebs肺炎球菌、伤寒杆菌的生长6；2114g/L可将肿瘤细胞完全溶解，而对正常血细胞、淋巴细胞无溶解作用，该功能与其抑制核酸合成有关。黄芪多糖(APS)体外应用可促进巨噬细胞产生IL-1，而抑制PCE3合成；体内应用可明显提高T淋巴细胞的转化，促进受抑制的IL-2的产生及IL-2受体的表达，进而增强T淋巴细胞的增殖。茯苓多糖能通过抑制肿瘤细胞DNA、RNA的合成而实现其对肿瘤细胞的直接杀伤作用，还能增强肝脏SOD活性而清除自由基，这些都是其抗肿瘤的机制。 (2)降血糖、降血脂作用 糖尿病是由于糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱引起的慢性病。植物多糖可保护和修复胰岛细胞，调节糖代谢酶活性、降低血糖水平，对糖尿病有显著的预防和治疗作用；还可降低血液中胆固醇、甘油三酯的含量，具有抗动脉硬化的作用。正常情况下，人体内脂质的合成与分解保持一个动态的平衡，一旦平衡遭到破坏，血脂含量的增高将使动脉内膜受到损伤，而导致动脉粥样硬化，从而诱发心脑血管疾病。研究发现，多糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖升高和肾上腺素致小鼠血糖升高都有明显的抑制作用，同时对肝糖元含量有明显的降低作用，可阻止肝脏中过多的糖元转变为血糖。黑木耳多糖可使小鼠血液中的胆固醇显著降低7。Kubo.K和Horio.H等发现灰树花子实体多糖可明显改善糖尿病的相应症状，同时还发现灰树花干粉可以显著降低高血脂血清中的胆固醇、甘油三脂和磷脂的水平，并促进肝脏脂肪和血脂的代谢，减轻体重。银耳多糖、茶叶多糖、魔芋多糖等既能降血糖又能降血脂8。 (3)抗衰老、抗氧化活性作用 衰老是由自由基引发的自然过程。某些多糖可抑制并清除体内自由基，促进超氧物岐化酶SOD的释放，提高抗氧化酶的活性，以增强机体对自由基的抗氧化能力和清除能力，进而保护机体膜系统的稳定性，增强体力，延缓衰老。Chen等报道了一种绿茶多糖缀合物对羟自由基、过氧化自由基和脂质过氧化反应抑制的半数感染浓度(IC50)分别是0.101、0.145 和0.238 mg/mL，并对SOD有一定的激活作用。谢红英等提取柚皮粗多糖，通过测定其还原能力及清除H2O2、O2-和OH的能力，对未除蛋白质和Sevag法、蛋白酶法去除蛋白质后的3种柚子皮多糖的抗氧化性进行比较，结果表明，Sevag法去除蛋白得到的柚皮粗多糖抗氧化能力最强，其清除H2O2、O2-和OH的能力分别为65.31%、95.04%和53.73%。 (4)抗病毒作用植物多糖对艾滋病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、乌肉瘤毒、劳斯肉瘤病毒等具有明显的抑制作用，已引起医药界的高度重视。如甘草多糖对牛艾滋病毒、腺病毒、柯萨基病毒均有较明显的抑制作用9，而红毛五加多糖对水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒型和柯萨基病毒B3型等3种病毒有明显的抑制作用10。在活体营养病原体企图进入植物细胞内时，植物细胞壁通常形成微小的乳突。乳突主要是由胼胝质(一种-(1,3)-葡聚糖)组成，起物理障碍作用，阻止病原体进入植物细胞。诱导胼胝质在胞间连丝内积累，也可阻止病原体在胞间移动。另外，细胞外存在的糖原白有很强的粘性，如羟脯氨酸丰富的糖原白，有助于加强细胞壁，从而防御病原体的袭击。1.3国内外关于多糖的提取研究现状目前我国多糖的提取方法主要有溶剂浸提法、酶解法、超滤法、微波辅助提取法，超声波辅助提取法及超临界流体萃取法等。多糖含量的测定有硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法，其中硫酸-苯酚法显色后稳定性较强，所以实验中一般都是采用硫酸-苯酚法。本实验测定多糖含量的方法采用苯酚-硫酸显色法，其原理是多糖成分在硫酸作用下，先水解成单糖，单糖迅速脱水生成糠醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，该化合物在490 nm波长处有特征吸收，由此可计算多糖含量。据文献报道桔皮的深加工和应用多集中在桔皮中精油、果胶以及黄酮等活性成分的研究，而对于桔皮多糖的开发研究报道较少。宋茹11等人利用微波法萃取柑橘皮多糖；董航12等人研究了橘皮粗多糖的提取工艺优化及抗氧化活性评价；李粉玲13等人利用超声波萃取橘红皮多糖。近年来欧美和日本等发达国家为了提高原料综合利用率降低成本提高附加值，相继从柑桔果皮中分离提取出许多功能性成份。在美国佛罗里达州，柑桔皮渣饲料是仅次于玉米的牛羊饲料，一般用来代替40-50%的玉米粉，是制作全价配合饲料的主要原料；巴西柑桔的综合加工利用做得非常成功，没有任何废弃物，除果汁外，还有果油香精化学药品等加工副产品。据介绍，年加工100万吨柑桔的加工厂，副产品的收入可达2500万美元。桔皮提取物能广泛应用于化学染料清漆和化妆品等领域14。桔皮多糖是一种潜在的天然活性物质，目前对砂糖桔皮多糖的超声波预处理热水浸提方法鲜有报道。超声波预处理因其独特的作用可避免长时间高温提取引起的试样分解和变质，具有选择性高、快速节能、节省溶剂、污染小等优点，已被应用于植物活性成分的提取中，本试验采用短时超声波前处理使砂糖桔皮细胞破裂，再通过后续热水浸提促进多糖的充分溶解，从而提高了多糖的提取率。1.3.1溶剂提取法 溶剂提取法是国内外提取多糖的常用传统方法之一，有水提、酸提和碱提。溶剂提取法一般应遵循相似相溶的原则，利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加乙醇使多糖沉淀出来15。多糖是极性大分子化合物，提取时一般选择水、醇等极性强的溶剂。谢善梅16等人以桔子皮为原料，通过单因素实验结合正交试验研究了桔子皮多糖的最优提取条件，实验结果表明：桔子皮精制多糖的最佳提取条件为：以水为提取剂，料液比1:35，80加热浸提90min，Sevage法除蛋白，再加有机试剂处理粗多糖中的色素、盐类和小分子物质等杂质后，在最佳提取条件下，桔子皮多糖的平均质量分数为2.36%。李志洲17等研究指出，采用V(红枣):V(水)1:20，90时浸提2h，反复浸提2次，红枣多糖的浸提率可达3.5%。水提醇沉法提取多糖简单方便，不需特殊设备，生产工艺成本低，安全无污染，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，而该法提取温度高，易降低多糖的活性成分成为该法的一个弊端。1.3.2超声波辅助提取法超声波提取是利用超声波的高频振荡作用，在动植物细胞组织内部形成局部高温、高压的环境使之破裂、并释放出内部有效成分18，进入溶剂后迅速与之混合。李粉玲等19采用超声波提取橘红皮多糖，结果表明，其最佳提取条件为：料液比1:40、提取时间40min、超声波功率120W、提取温度60，浸提三次，此条件下1g橘红皮可提取多糖9.13g；胡斌杰等利用超声波法与传统热水法提取灵芝多糖发现，超声波法较传统热水法提取时间缩短3/4，多糖提取率高30%；朱开梅等20用超声波法提取香蕉皮多糖的研究得出结论，其提取的最佳条件为：超声时间210s，超声功率320W，料液比1:50，提取温度为50，水提1h，提取4次。 超声波辅助提取与单纯的水煮法醇沉法相比，提取时间短，萃取充分，多糖活性成分损坏少；与浸泡法相比，提取率高。可以广泛应用到植物多糖的提取当中去。1.3.3 微波辅助提取法 微波萃取是利用微波强大的穿透力，使溶剂到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。岳贤田21等利用微波辅助提取柚子皮多糖，确定柚子皮多糖提取的最佳工艺参数：微波功率500W，辐射时间为5mim,提取料液比1:50，提取温度80，浸提时间为4h，乙醇浓度为80%。在此条件下提取柚子皮多糖，其得率达到了17.23%；杨静22等研究了微波辅助提取桔皮中天然抗氧化剂的研究，结果得出：在功率为900W，提取溶剂的固液比为1:30，提取温度为75，提取时间为7mim，乙醇体积分数75%的条件下，桔皮黄酮的得率为12.04%。微波辅助提取多糖和其他的萃取方法比较，微波萃取效率高，回收率高，操作简单，易于控温，多糖纯度高，无污染，符合环境保护要求，也是较好的多糖提取方法之一。1.3.4 酶解法酶解法是指在天然物分离、提取过程中，利用酶的催化活性，使多糖的提取过程在较温和的条件下进行，同时利用酶的高选择性，降低细胞壁、蛋白质等对细胞内多糖的阻碍，获得较高的提取率。张文超等23对金针菇多糖的酶法提取进行了研究，采用木瓜蛋白酶，最佳提取条件为：温度60，pH 6.5，酶添加量为原料体积的2 %，提取时间2 h，在最佳提取条件下，金针菇多糖的提取率为20.32 %；吴佳慧等24利用酶法提取香菇中的多糖，通过添加漆酶、果胶酶和纤维素酶酶解香菇后用乙醇沉淀法提取香菇多糖，采用单因素试验和响应面法探讨了以上三种酶的交互作用及其最佳水平，并得出其对香菇多糖的提取效果的影响，研究结果表明，反应温度在40、料液比1:15、乙纤维素酶浓度为6.82%、果胶酶浓度为7.11%、漆酶浓度为3.69%的条件下，香菇多糖的提取率高达37.07%。1.3.5 超临界萃取法 超临界萃取是以超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某种成分，并进行分离的一种技术。由于超临界流体同时具有气体的高扩散性、高渗透性，又具有液体的高溶解性，并且这些特性可以通过调节温度和压力加以改变，因而可以达到分离提取的目的。张素霞25采用超临界CO2辅助提取法，研究了萃取压力、萃取温度和萃取时间对香菇多糖提取率的影响，结果表明萃取压力是影响最大的因素，其次是萃取温度，最佳提取工艺为萃取压力10MPa，萃取温度40，萃取时间1 h。与传统水提法相比能够显著提高多糖的提取率。1.4研究的目的和实际意义 随着人类社会的快速发展，生活环境污染的加剧，加上不良的饮食习惯，一些疾病(如癌症、爱滋病、糖尿病)的发病率上升，严重威胁着人类的健康。研究表明砂糖桔皮中含有大量的多糖、橙皮甙、柠檬苦素、香精油、类黄酮、类胡萝卜素等成分，这些天然植物的活性成分对疾病的预防和治疗有重大意义，因此提取桔皮中的活性成分成为目前研究的热点。砂糖桔甜爽可口，果皮约占果实重的15%31%，果实大多数被作为鲜果食用，部分被用来加工成果汁，果酒等，深受消费者的喜爱。然而食用或加工后将会产生大量的皮渣，被作为废弃物处理，不仅浪费资源使其得不到有效利用，又增加了环境污染程度。砂糖桔皮多糖除具有营养功能外，还具有免疫调节能力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖、降血脂等功能，目前被广泛用于食品、美容、保健、医疗等行业。而当前关于砂糖桔皮多糖的研究较少，为提高砂糖桔原料综合利用率，降低成本提高附加值，使砂糖桔皮多糖产品能用于规模化工业生产和新型保健产品的开发，还需要对砂糖桔皮多糖的提取、精制、纯化工艺等进行优化，且需大量的实验室研究和中间工业性试验，深入研究探讨砂糖桔皮多糖的应用价值及其市场开发情况等。本试验采用超声波辅助-热水浸提法提取砂糖桔皮多糖，超声波预处理因其独特的机械作用可避免长时间高温提取引起的试样分解和变质，具有选择性高、快速节能、节省溶剂、污染小等优点，故采用短时超声波前处理使砂糖桔皮细胞破裂，再通过后续热水浸提促进多糖的充分溶解，从而提高了多糖的提取率。实验对提取物粒度大小、超声波提取时间、浸提时间、料液比、提取温度进行考察，并在单因素试验的基础上进行正交实验来确定最佳的浸提条件，从而获得最优化的工艺条件，得到最好的浸提效果。为多糖生物活性的开发提供参考数据，且为砂糖桔皮的全方位开发应用积累有价值的资料。第2章 材料和方法2.1原料和试剂2.1.1原料购自永州市零陵区步步高超市的新鲜砂糖桔。2.1.2试剂表2-1 主要试剂 Tab.2-1 Main reagents 试剂纯度厂家正丁醇分析纯天津市大茂化学试剂厂无水乙醇溶剂天津市大茂化学试剂厂乙醚溶剂天津市大茂化学试剂厂苯酚分析纯天津市大茂化学试剂厂氯仿分析纯天津市大茂化学试剂厂95%乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂浓硫酸分析纯天津市大茂化学试剂厂葡萄糖分析纯吴江旺盛化工有限公司2.2仪器和设备表2-2 主要仪器设备 Tab.2-2 Experiment equipment and instrument 仪器型号厂家新型电热恒温鼓风干燥箱WG-71天津市泰斯特仪器有限公司循环水真空泵SHB-III郑州长盛实验仪器有限公司超声提取仪GDY-701S长春吉大小天鹅仪器有限公司可见光分光光度计H722B天津市普瑞斯仪器有限公司三用恒温水浴锅HH江苏国胜实验仪器厂台式高速离心机TG16G湖南省凯达科学仪器有限公司旋转蒸发器201D-II郑州长城科工贸有限公司植物粉碎机FZ-102上海胜启仪器仪表有限公司2.3实验方法2.3.1制作工艺流程超声波辅助-热水浸提法流程：原料洗净剥皮切片烘干乙醇浸泡烘干研磨粉碎超声波提取称量加蒸馏水热水浴浸提冷却离心取上清液过滤浓缩醇沉离心洗涤旋转蒸发干燥粗多糖。精制多糖：粗多糖复溶正丁醇+氯仿溶液(1+5)震荡离心分液去蛋白取上清液用3倍体积的相应浓度的乙醇沉淀乙醇和乙醚洗涤精多糖。多糖含量的测定：精多糖复溶稀释移取适量5%苯酚+浓硫酸(1+5)震荡水浴取出冷却490nm处测量吸光值计算。2.3.2实验研究(1) 购买原料 在湖南省永州市零陵区步步高超市选购新鲜砂糖桔。(2) 原料预处理 洗净砂糖桔外表泥沙，把砂糖桔皮和果肉分开，然后剪片，大小分别为5mm5mm、2mm2mm左右。(3) 干燥 分别将剪好片的砂糖桔皮，移入新型电热恒温鼓风干燥箱，设置干燥箱温度70，桔皮片可用手搓碎成粉碎颗粒表示干燥完成。(4) 乙醇浸提除杂 量取250mL95%乙醇，倒入500mL大烧杯中，再用电子分析天平称取30g砂糖桔片，也加入大烧杯。再水浴加热大烧杯，温度为40，水浴时间2h，以此除去表面脂肪、多酚、低聚糖和皂苷等物质，抽滤并挥干，最后收集滤渣，于70烘箱中烘干，待用。(5) 冷却 取出冷却，再将一部分5mm5mm桔皮片用FZ-102植物粉碎机搅碎，过20目圆孔筛，混匀，密封保存。(6) 5%苯酚溶液配制 先称取5g苯酚，加蒸馏水95ml溶解，摇匀，制得5%苯酚溶液，现配现用。2.3.3绘制葡萄糖标准溶液工作曲线精密称取0.05g干燥至恒重的葡萄糖，用干燥洁净的500mL容量瓶定容，制成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。准确移取葡萄糖标准溶液0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.80mL，分别置于10mL具塞试管，再按顺序分别加入蒸馏水0.95mL、0.90mL、0.80mL、0.70mL、0.60mL、0.50mL、0.40mL、0.20mL，另取一支具塞试管加入蒸馏水1.00mL 作为空白实验，再分别向上面试管加入5%苯酚溶液各1.0mL，浓硫酸5.0mL摇匀。各管加完后一起浸于40水浴中30min，管口盖上塞子防止蒸发。取出冷却15min左右，以空白管调零，于490nm波长处测定吸光度，以同样处理的蒸馏水为试剂空白进行比色。再绘制标准曲线，计算回归方程。2.3.4砂糖桔皮粗多糖的提取分别取定量处理过的砂糖桔皮，以热水作为溶剂，采用不同的超声波时间、不同粒度的砂糖桔皮、提取温度、料液比、提取时间对滤渣进行多糖的提取。合并滤液，用旋转蒸发仪真空浓缩至原滤液体积的1/5，再加入相当于溶液体积3倍的无水乙醇，多糖呈絮状沉淀析出。5000r/min离心分离10min，取上清液，加无水乙醇放置过夜，沉淀析出多糖，离心，合并两次沉淀物，用加95%乙醇洗涤，旋转蒸发干燥，得砂糖桔皮水溶性粗多糖。2.3.5砂糖桔皮水溶性多糖精制精制砂糖桔皮多糖主要是除去其中的杂蛋白。除蛋白质有多种方法，本实验采用的是Sevage法。由最佳提取条件制得的粗多糖，用少量蒸馏水溶解砂糖桔皮多糖，按氯仿-正丁醇(V/V=5:1)与粗多糖溶液混合液以体积比1:5混合，充分振荡30min静置分层，分液除去中间液面白色类似凝胶的蛋白层。5000r/min离心15min，取上清液用3倍体积的95%的乙醇沉淀，再用无水乙醇、乙醚洗涤多次，得砂糖桔皮水溶性精多糖。2.3.6砂糖桔皮多糖提取的单因素试验1）砂糖桔皮粒度大小对砂糖桔皮多糖提取率的影响（A、B、C号分别代表：经过20目圆孔筛、2mm2mm、5mm5mm的砂糖桔皮，下同）分别准确称取1.0g不同粒度(A、B、C)的砂糖桔皮，在超声时间为4min、提取时间为2h、提取温度为70、料液比1:20的情况下，对砂糖桔皮进行处理，按照上述的方法，精制多糖显色后，用分光光度计于490nm波长处测定其吸光度，计算出多糖提取率，确定最佳提取的砂糖桔皮粒度大小。2）超声波提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响准确称取2mm2mm（B）大小的砂糖桔皮1.0g，在提取时间为2h、提取温度为70、料液比为1:20的情况下，采用不同的超声波提取时间(2min、3min、4min、5min、6min)，对砂糖桔皮进行处理，然后用分光光度计于490nm波长处测定多糖的提取率，确定最佳超声波提取时间。3）料液比对砂糖桔皮多糖提取率的影响准确称取2mm2mm（B）大小的砂糖桔皮1.0g，在超声波提取时间为4min，提取温度为70、提取时间为2h，采用不同的料液比(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)，对砂糖桔皮进行处理，然后用分光光度计于490nm波长处测定多糖的提取率，确定最佳料液比。4） 提取温度对砂糖桔皮多糖提取率的影响准确称取2mm2mm（B）大小的砂糖桔皮1.0g，在超声波提取时间为4min、料液比为1:20、提取时间为2h，采用不同的提取温度(60、70、80、90、100)，对砂糖桔皮进行处理，然后用分光光度计于490nm波长处测定多糖的提取率，确定最佳提取温度。5） 提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响准确称取2mm2mm（B）大小的砂糖桔皮1.0g，在超声波提取时间为4min，提取温度为70、料液比1:20，采用不同的提取时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)，对砂糖桔皮进行处理，然后用分光光度计于490nm波长处测定多糖的提取率，确定最佳提取时间。2.3.7正交试验在单因素研究的基础上，设计L9(34)正交试验，本试验选取了超声波提取时间(t)、提取温度(T)、提取时间(t)和料液比(m/V)4个影响因素，研究它们对砂糖桔皮水溶性多糖的提取率的影响。具体步骤如下：将待用2mm2mm大小砂糖桔皮以不同料液比m/V(1:25、1:30、1:35)溶于水中，在不同超声波提取时间(3min、4min、5min)，不同的提取温度t(60、70、80)，不同的热水浴浸提时间T(2h、2.5h、3h)，冷却至室温，过滤，5000r/min离心10min，取上层清液。用旋转蒸发仪真空浓缩，加无水乙醇放置过夜沉淀析出多糖，沉淀物用蒸馏水复溶后再加95%乙醇洗涤，真空干燥，得砂糖桔水溶性粗多糖，精制过后，按上述方法进行显色反应，再测定吸光值，得出最佳的砂糖桔皮多糖的提取条件。2.3.8砂糖桔皮水溶性精多糖含量的测定将得到的砂糖桔皮精多糖复溶至10mL，精确吸取1mL复溶的多糖溶液，稀释至100mL，再准确移取1mL稀释1000倍的多糖复溶液，按苯酚-硫酸法显色后，以试剂空白作参比，用分光光度计于490nm波长处测吸光度，并根据回归方程得到浓度，再计算出总糖的含量。1) 多糖含量公式：c精多糖溶液的浓度2)多糖提取率公式：Z多糖提取率；m多糖含量，mg；m0样品质量，mg。2.3.9砂糖桔皮多糖提取的稳定性实验 由最佳提取条件对砂糖桔皮多糖进行提取与精制，做四组平行实验，得出实验数据，求得平均值。第3章 结果和分析3.1葡萄糖标准溶液工作曲线图根据试验方法测得的葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的数据，得出回归方程为：A=0.5775x+0.0431，相关系数R=0.9974(式中x为多糖浓度mg/mL；A为吸光度)。表明测定吸光度与葡萄糖浓度呈良好的线性关系(图3-1)。图3-1 葡萄糖的标准曲线Fig.3-1 Astand curve of glucose3.2砂糖桔皮粒度大小对砂糖桔皮多糖提取率的影响由图3-2可知，经过植物组织粉碎机粉碎过20目圆孔筛的砂糖桔皮粉末(A)的多糖提取率最高，为6.47%，2mm2mm(B)大小的砂糖桔皮次之，为6.20%，而粒度大小为5mm5mm(C)的提取率明显变小，仅为3.12%。可能原因是桔皮粒度越小与溶剂接触的面积就越大，其中的多糖更能充分的被溶解。但由于经过植物组织粉碎机粉碎的样品过滤存在难于过滤的问题而2mm2mm大小的砂糖桔皮的多糖得率与粉碎样差别不大，且后续操作过程更简单方便，故采用2mm2mm(B)大小的砂糖桔皮是更合适的。图3-2 砂糖桔皮粒度大小对多糖提取率的影响Fig.3-2 The impact of granularity on extraction rate of polysaccharides3.3超声波提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响由图3-3可知，在砂糖桔皮粒度大小相同、提取温度相同、提取时间相同、料液比也相同的时候，超声波提取温度不同，砂糖桔皮多糖的提取率不同。由趋势图可以看出，随着超声波提取时间的延长，砂糖桔皮多糖的提取率也随之增长，当超声波提取时间为4min时，多糖提取率达到最大值2.06%，随后开始呈下降趋势。故超声波提取时间为4min时砂糖桔皮多糖的提取率最高。因此最佳超声波提取时间为4min。图3-3 超声波提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响Fig.3-3 The impact of ultrasonic-extraction time on extraction rate of polysaccharides3.4料液比对砂糖桔皮多糖提取率的影响分析图3-4可知，随着料液比中水的比重逐渐加大，砂糖桔皮多糖的提取率也随之增长。当提取的料液比达到1:30时，砂糖桔皮多糖提取率最大，为4.34%。当提取的料液比由1:30到1:35的时候，提取率逐渐减小。这种现象的产生是由于在相同溶解度状态下，随着溶剂量的增加，溶质的溶解量也增加，但在此溶解度下，当多糖已基本全部溶解，此时溶剂中溶质的量己基本恒定，再增加溶剂的量也不会使溶剂中溶质的量增加。且提取液在后续工序中需经浓缩，若初期加水量过大会使后续工序能耗增加，效率降低，因此宜选取料液比1:30。 图3-4 提取料液比对砂糖桔皮多糖提取率的影响 Fig.3-4 The impact of material-water ratio on extraction rate of polysaccharides3.5提取温度对砂糖桔皮多糖提取率的影响由图3-5可知，在砂糖桔皮粒度相同、提取时间相同、超声波提取时间相同、料液比也相同的时候，提取温度不同，砂糖桔皮多糖的提取率不同。观察趋势图可以看出，随着浸提时间的延长，砂糖桔皮多糖的提取率也随之增长。当提取温度达到70，提取率达到最大值4.48%。当温度超过70，提取率随温度升高而下降。可能是因为在一定的温度范围之内，较高的温度易于使细胞壁破碎而使活性多糖溶出，而温度过高可能导致提取剂水蒸发，使溶质得不到更好的浸提。因此70是提取砂糖桔皮多糖的最佳温度。 图3-5 提取温度对砂糖桔皮多糖提取率的影响 Fig.3-5 The impact of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides3.6提取时间对砂糖桔皮多糖提取率的影响本实验采用在砂糖桔皮粒度为2mm2mm、提取温度为70、超声波提取时间4min、料液比为1:20的情况下，采用不同的提取时间t=(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)，对砂糖桔皮进行处理，然后测定多糖的提取率，结果见图3-6。由图可知，随着浸提时间延长，多糖的提取率也逐渐升高，当提取时间为2.5h时，多糖的提取率达到最高峰5.19%。当浸提时间超过2.5h时，曲线随浸提时间延长而下降。可能原因是加热时间过长导致多糖发生部分水解，故最佳提取时间为2.5h。 图3-6提取时间砂糖桔皮多糖提取率的影响 Fig.3-6 The impact of extraction time on extraction rate of polysaccharides3.7砂糖桔皮多糖提取正交实验砂糖桔皮多糖的提取主要与超声波提取时间(t1)、提取时间(t2)、提取温度(T)以及料液比(m/V)有关。本实验采取正交试验法来确定其最佳的提取条件。如表3-1、表3-2。表3-1正交试验的提取条件因素水平表Table3-1 The factors and levels of orthogonal experiment with extraction conditions水平因素提取温度T/ (A)料液比m/V (B)提取时间t2/h (C)超声波提取时间t1/min (D)1601:25232701:302.543801:3535表3-2提取条件正交试验表Table3-2 The orthogonal experiment table of extraction condition实验序号 因素与水平多糖提取率（%）ABCD111113.69212224.43313333.95421235.04522315.12623124.07731323.92832134.02933214.24K112.0612.6511.7713.05K214.2313.5713.7112.43K312.1912.2513.0013.00k13.023.162.943.26k23.563.393.433.11k33.053.063.253.25R2.161.321.940.62由表2对砂糖桔皮多糖的提取条件进行分析，极差值R依次为A(提取温度T)C(提取时间t2)B(料液比m/V)D(超声波提取时间t1)，说明提取温度是影响砂糖桔皮多糖提取的主要因素。从正交试验结果可以看出，砂糖桔皮多糖提取条件的最佳方案是A2B2C2D1，即砂糖桔皮多糖提取的最佳条件是提取温度70、料液比1:30、提取时间2.5h、超声波提取时间3min。3.8最佳条件下精制多糖的提取率 由上述得出的最佳条件提取砂糖桔皮多糖，做四组平行实验，数据如表3-3所示。 表3-3最佳条件下精制多糖的提取率 Table 3-3 yield of refined polysaccharide under the best condition次数1234平均值精制多糖提取率（%）5.1435.3955.2675.2165.255第4章 结论与讨论4.1砂糖桔皮水溶性多糖的最佳提取条件及提取率(1)本试验以超声波辅助-热水浸提法研究了提取砂糖桔皮水溶性多糖的工艺。单因素试验得出的最佳条件及提取率如下：过20目圆孔筛的砂糖桔皮的多糖提取率最高为6.47%，2mm2mm大小的砂糖桔皮次之，为6.20%，但因粉碎的样品存在过滤难的问题而2mm2mm大小的砂糖桔皮的多糖提取率与粉碎样的差别不大，且后续操作过程更简单方便，故采用2mm2mm大小的砂糖桔皮更合适；超声波处理4min时提取率最大为2.06%；料液比为1:30时提取率达到4.34%；提取温度70时提取率为4.48%；提取2.5h时提取率最大为5.19%。(2)考虑单因素对砂糖桔皮多糖提取的影响，再采用正交试验法考察了提取温度、料液比、提取时间和超声波提取时间对砂糖桔皮多糖的提取率和含量的影响，确定了较佳的提取工艺条件如下：提取温度为70、料液比1:30、提取时间2.5h和超声波提取时间为3min；根据此条件，对砂糖桔皮水溶性精多糖提取进行稳定性实验，得出平均提取率为5.255%。(3)砂糖桔中的总糖含量高达13.06%1，用微波提取橘红皮中的多糖含量可达到2.377%13；李粉玲用超声波萃取橘红皮中的多糖，平均得率为0.913%；谢善梅16等测得桔皮中多糖平均质量分数为2.36%；而本研究采用最佳提取方法得到的多糖平均提取率相对较高，为5.255%，说明采用本试验的优化方法提取砂糖桔皮多糖是可取的。4.2本论文的优缺点 (1)本试验以超声波辅助处理使植物组织破裂，细胞中的物质更好地进入溶剂中，大大提高了多糖的提取率，同等程度下节约了热水浸提的时间。为广泛提取砂糖桔皮中的活性成分提供了新方法。(2)本试验测定吸光值前对多糖进行了精制纯化处理，除去了其中的脂质类、蛋白质等物质，这种纯化处理可以避免杂质对显色反应的影响，从而提高了数据的精确性。(3)提取过程中离心后再过滤，多糖的损失小且除杂的效果好。因为去除色素步骤繁杂，提取的多糖溶液中虽含有较少的色素，经综合考虑并没有将其色素除去，在测定时可能也存在些许的影响。(4)用于浸提的乙醇试剂耗费比较大，建议工业化生产之后对废弃的乙醇进行重蒸，循环使用；提取完的残渣中还含有其他对人类有用的物质，建议收集后再利用。参考文献1 黄丽华.砂糖桔营养成分分析J.食品研究与开发，2007,28(1):152-154.2 金迪，梁英，孙工兵，等.植物多糖提取技术的研究进展J.黑龙江八一农垦大学学报，2011,23(5):76-79.3 王涛，赵谋明.多糖的研究进展J.现代食品科技，2006,23(1):103-106.4 宫丹，杜培革，崔新颖.植物多糖的免疫调节及抗肿瘤活性研究J.北华大学学报，200