糖代谢相关检验

第九章糖代谢相关检验 学习内容 第一节血糖测定 第二节血清糖基化蛋白测定 第三节胰岛素释放及C肽释放试验 第四节糖代谢产物测定 第五节其他糖测定 学习目标 掌握血糖及口服糖耐量试验的概念 实验原理 操作方法及临床应用 掌握糖化血清蛋白测定的原理 方法学评价及临床应用 熟悉胰岛素及胰岛素释放试验的临床应用 熟悉C 肽及C 肽释放试验的临床应用 了解血乳酸 丙酮酸 羟丁酸及其他糖的测定 能规范 熟练地进行血糖测定 口服糖耐量试验 糖化血红蛋白和糖化血清蛋白的测定 并正确解释实验结果 糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物 糖代谢 carbohydratemetabolism 指葡萄糖 glucose Glc 糖原 glycogen Gn 等在体内的一系列复杂的化学反应 在人体内糖的主要形式是葡萄糖 glucose Glc 及糖原 glycogen Gn 葡萄糖是糖在血液中的运输形式 在机体糖代谢中占据主要地位 糖原是葡萄糖的多聚体 包括肝糖原 肌糖原和肾糖原等 是糖在体内的储存形式 葡萄糖与糖原都能在体内氧化提供能量 前言 临床常用检测试验 血糖浓度测定 口服葡萄糖耐量试验 糖化血红蛋白测定 糖化血清蛋白测定 胰岛素及胰岛素释放试验 C 肽及C 肽释放试验 糖代谢产物 血乳酸 丙酮 羟丁酸 测定 其他糖 果糖 半乳糖 测定等 第一节血糖测定 血糖一般指血液中的葡萄糖 在激素等因素的调节下 血糖浓度保持相对恒定 健康人群空腹血糖的参考范围通常为3 89 6 11mmol L 70 110mg dl 但2003年美国糖尿病协会 ADA 建议下调参考范围上限为5 6mmol L 100mg dl 血糖 血糖浓度取决于血糖的来源及去路的动态平衡 血糖的来源主要受机体进食的影响 而去路则取决于机体对血糖的利用 一 糖代谢概述 根据机体所处的不同状态 血糖主要有三个来源 1 食物中糖类的消化吸收2 糖原的分解3 非糖物质的转化 一 血糖的来源 葡萄糖的代谢过程根据机体的需要而定 主要代谢去路有 1 有氧氧化2 合成糖原3 转换为非糖物质4 转换为其他糖类衍生物5 生成尿糖 二 血糖的去路 血糖的来源与去路 血糖如何维持稳定 关键酶调节关键酶如何调节激素调节常见的升高血糖的激素胰高血糖素 糖皮质激素和肾上腺素常见的降低血糖的激素胰岛素 二 血糖浓度的调节 定义 胰岛素 insulin 是由胰岛 细胞合成分泌的多肽激素 它主要作用于肝脏 骨骼肌和脂肪组织 功能 一方面促进这些组织细胞摄取葡萄糖 并转换成糖原或脂肪贮存 另一方面抑制肝脏的糖原分解和糖异生 从而降低血糖 一 降低血糖的激素 胰岛素 定义功能 化学构成人胰岛素含51个氨基酸残基 分子量5808 由A B两条链组成 含两个链间二硫键和一个链内二硫键 人胰岛素有别于其他生物的胰岛素 但其B链的C末端 B23 B26 具有高度保守性 是胰岛素生物学活性的决定性区域 故不同来源的胰岛素在免疫学和生物学活性上有相似性 一 降低血糖的激素 胰岛素 合成过程首先在胰岛 细胞的核糖体上合成含100个氨基酸残基的前胰岛素原 preproinsulin 前胰岛素原很快被酶切去信号肽 生成86个氨基酸的胰岛素原 proinsulin 最后胰岛素原通过蛋白酶作用 切掉4个氨基酸残基 水解为51个氨基酸的胰岛素和31个氨基酸的C 肽 C peptide 一 降低血糖的激素 胰岛素 一 降低血糖的激素 胰岛素 前胰岛素原 preproinsulin 胰岛素原 proinsulin 胰岛素 insulin C 肽 C peptide 释放激动剂 葡萄糖 氨基酸 胰腺 胃肠激素等 阻断剂 高血糖 生长抑素和 肾上腺素能 一 降低血糖的激素 胰岛素 胰岛素主要为肝脏摄取并降解 少量由肾小球滤过 并在近曲小管重吸收和降解 胰岛素在体循环中的生物半寿期为4 5min 主要通过胰岛素和胰岛素受体的结合 触发细胞内特异性的信号转导 从而产生相应的生物学效应 一 降低血糖的激素 胰岛素 降解作用机制 胰岛素样生长因子 insulinlikegrowthfactors IGF 是一种多肽 与胰岛素的结构相似 具有类似于胰岛素的代谢作用和促生长作用 主要有IGFI和IGFII IGFI又称生长调节素C somatomedinC 是细胞生长和分化的主要调节因子之一 而IGFII的生理作用尚不清楚 IGFI主要由肝脏产生 其他许多阿组织也可合成IGFI 但不入血 仅在局部发挥作用 血液中 IGF浓度约比胰岛素高1000倍 但绝大部分与特异性蛋白质结合 仅少量以游离形式存在 而胰岛素在血液中全部是游离的 因此相比胰岛素 血液中IGF的活性很低 IGF通过特异性的IGF受体或胰岛素受体而发挥作用 一 降低血糖的激素 胰岛素样生长因子 IGFI在正常糖代谢中的作用尚不清楚 外源性注入可导致低血糖 而IGFI缺乏可引起生长迟缓 胰腺外肿瘤可致IGF的生成过量 患者可有饥饿性低血糖 测定IGFI浓度可评价生长激素的缺乏和过量 监测机体的营养状况 一 降低血糖的激素 胰岛素样生长因子 胰高血糖素和肾上腺素 二 升高血糖的激素 刺激葡萄糖释放 减少葡糖糖利用 生长激素和皮质醇 血糖的激素调节 如果调节失衡 结果是什么 高血糖或者低血糖低血糖 低于2 8mmol L 高血糖 高于7 1mmol L 高于8 89mmol L 出现糖尿 最常见病理性高血糖 糖尿病 高血糖症与糖尿病 高血糖症 hyperglycemia 是糖代谢紊乱导致血糖浓度高于参考上限的一种异常现象 主要表现为空腹血糖损伤 糖耐量减退或糖尿病 其中 空腹血糖损伤和糖耐量减退是正常糖代谢与糖尿病之间的中间状态 皆系发展为糖尿病及心血管病变的危险因子和标志 而糖尿病是一组严重的代谢性疾病 糖尿病的发病机制与分型 糖尿病 diabetesmellitus DM 是一组由于胰岛素分泌不足或 和胰岛素作用低下而引起的糖代谢紊乱性疾病 分型 型糖尿病 型糖尿病临床症状 三多一少 即多尿 烦渴 多饮和体重减轻 型糖尿病又叫青年发病型糖尿病或胰岛素依耐型糖尿病 原因 胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏 从而完全失去了产生胰岛素的功能 治疗 依赖胰岛素治疗 型糖尿病又叫非胰岛素依耐型糖尿病 原因 自身能够产生胰岛素 但细胞无法对其作出反应 使胰岛素无法发挥作用 治疗 需要胰岛素单独或与口服药联合应用的治疗 测定方法无机化学法有机化学法酶法参考范围3 9 6 1mmol L 70 110mg dL 临床意义高血糖症低血糖症 三 血清 浆 葡萄糖测定与评价 原理葡萄糖在和碱性铜试剂混合加热后 可使Cu2 还原成Cu 后者与磷钼酸试剂作用生成蓝色的钼蓝 通过比色法测定蓝色化合物 计算出血糖的含量特异性差 易受其他还原性物质的干扰 现已淘汰空腹正常血糖参考值4 4 6 7mmol L或80 120mg dL 无机化学法 Folin Wu法 有机化学法 邻甲苯胺法 原理 葡萄糖为一含醛基的已糖 在酸性条件下加热 可脱水生成5 羟甲基 2 呋喃甲醛 后者与邻甲苯胺缩合成青色的Schiff碱 Schiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比 评价 操作简便 特异性高 操作简便 可直接采用血浆或血清进行测定 但其使用的试剂具有腐蚀性和致癌性 现应用较少 酶法 葡萄糖氧化酶 GOD 法 己糖激酶 HK 法 葡萄糖脱氢酶法 国际公认 国家推荐 实验9 1葡萄糖氧化酶 glucoseoxidase GOD 法测定血糖 原理 葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸 并释放过氧化氢 过氧化氢在过氧化物酶 peroxidase POD 作用下 分解为水和氧的同时将无色的4 氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物 红色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比 在510nm波长处测定吸光度 与标准管比较可计算出血糖的浓度 试剂准备磷酸盐缓冲液 0 1mol L pH7 0 酶试剂葡萄糖氧化酶1200U 过氧化物酶1200U 4 氨基安替比林10mg 溶于上述磷酸盐缓冲液80mL中 调pH7 0 定容至100mL 2 8 保存 可保存3个月酚溶液重蒸馏酚100mg溶于100mL蒸馏水中 避光 2 8 保存 可保存1个月苯甲酸溶液 12mol L 葡萄糖标准液 5 0mmol L 实验操作 混匀 置37 水浴保温15分钟 每管加蒸馏水0 5ml 在510nm波长处比色 以空白管调零 读取各管吸光度 根据各管吸光度计算其血糖浓度 结果计算 取3支试管 按下表操作 葡萄糖含量 mmol L 自动化分析仪检测 试剂主要成分与手动检测类似 见试剂盒说明书 工作液配置 根据标本量 临时将酶试剂与缓冲液按照1 4比例混匀 操作定标 质量控制 标本上机结果计算1mg dLX0 0555 0 0555mmol L 葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液的葡萄糖含量 但不能直接测定尿液葡萄糖含量 这是因为尿液中的尿酸等干扰物质浓度过高 可干扰过氧化物酶反应 造成结果假性偏低 对于血液样品需及时分离红细胞 因为红细胞的酵解将会导致测定结果偏低 建议测定样品以草酸钾 氟化钠为抗凝剂以抑制糖酵解 注意事项 严重黄疸 溶血及乳糜样血清先制备无蛋白血滤液 然后在进行测定 酶酚混合液一般现用现配 葡萄糖氧化酶对 D葡萄糖高度特异 溶液中的葡萄糖约36 为 型 64 为 型 葡萄糖的完全氧化需要 型到 型的变旋反应 葡萄糖变旋酶 可加速这一反应 延长孵育时间可达到完成自发变旋过程 新配制的葡萄糖标准液主要是 型 故须放置2h以上 最好过夜 待变旋平衡后方可应用 注意事项 计算 葡萄糖标准液 5mmol L血清葡萄糖 mmol L AT AS CS 参考值 3 9 6 1mmol L 本法测定葡萄糖非常特异 从原理反应式中可知第一步是特异反应 第二步特异性较差 误差往往发生在反应的第二步 一些还原性物质如尿酸 维生素C 胆红素和谷胱甘肽等 可与色原性物质竞争过氧化氢 从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢 产生竞争性抑制 使测定结果偏低 但是对测定结果无显著影响 实验误差分析 实验9 2己糖激酶 HK 法测定血糖 原理 NADPH在340nm有吸收峰 其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正比 评价 本法特异性高 灵敏度高 干扰因素少 适用于自动化分析 为葡萄糖测定的参考方法 但是试剂较贵 试剂盒配方 实验操作 2 混匀 置37 水浴保温10分钟 在340nm波长处比色 比色皿光径1cm 以蒸馏水调零 读取各管吸光度 根据各管吸光度计算其血糖浓度 3 结果计算 1 终点法 1 按下表操作 实验操作 2 速率法以半自动生化分析仪为例 1 主要参数如下系数8 2孵育时间30s监测时间60s波长340nm比色皿光径1 0cm温度37 吸液量0 5mL 2 加样 3 结果计算血清葡萄糖 mmol L A T 8 2 注意事项及评价 试剂要求 各工具酶均需高纯度产品 准确度及精密度较高 适用于自动分析仪 但试剂较贵 己糖激酶法测定血糖不收轻度溶血 脂血 黄疸 尿酸 维生素C等干扰 但严重溶血的标本会影响测定结果 罕见病症病例 特别是IgM型中 血液葡萄糖测定结果不可靠 不同检测方法所提供的空腹正常血糖参考值存在差异 葡萄糖氧化酶法 3 9 6 1mmol LFolin Wu法 4 4 6 7mmol L邻 甲苯胺法 3 9 6 1mmol L 葡萄糖氧化酶法 该法特异性高 反应条件温和 能反映血中葡萄糖的真实含量 且已推广出试剂盒 广泛应用与临床 己糖激酶法 特异性高 灵敏度高 干扰因素少 适用于自动化分析 为葡萄糖测定的参考方法 但是试剂较贵 Folin Wu法 该法对葡萄糖无特异性 一切还原物质均可产生同样的反应 邻 甲苯胺法 该法涉及强酸 加热等反应条件 不便于大规模检测 且邻甲苯胺须蒸馏后使用 有毒性 临床和科研上已很少采用 血糖测定方法特点 测定方