中国药品检验标准操作规范2010年版化学药部分115灭菌法.doc

灭菌法1 简述凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。灭菌的手段及设备。分别称为灭菌法及灭菌器。确切地讲，灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率下将至预期的无菌保证水平的方法。最终灭菌的物品微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于10-6。物品的无菌保证水平与灭菌工艺、灭菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相关。已灭菌物品达到的无菌保证水平可通过验证确定。常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。在药品检验工作中，无论采用何种灭菌方法，都应考虑到原有成分的稳定性和安全性，对灭菌条件要求灭菌完全之外。还必须保证被灭菌物质成分不被破坏，不影响物品的质量。本标准操作规范适用于药品检验工作中培养基和器材等的灭菌。2 灭菌方法2.1 湿热灭菌法本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法，湿热灭菌包括煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽和高压蒸汽灭菌等。湿热灭菌条件的选择应考虑灭菌物品的热稳定性、热穿透力、微生物污染程度等因素。煮沸、巴氏消毒、流通蒸汽不能有效杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。高压蒸汽灭菌灭菌能力强。为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。2.1.1 适用范围药品、容器、培养基、无菌衣、胶囊、敷料、玻璃器材、传染性污染物以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。不能用于凡士林等油类和粉剂的灭菌。2.1.2 压力蒸汽灭菌器根据排放冷空气的方式和程度不同。分为下排气压力蒸汽灭菌器和预真空压力蒸汽灭菌器二大类。2.1.2.1 下排气式压力蒸汽灭菌器利用重力置换原理，使热蒸汽在灭菌器中从上而下，将冷空气由下排气孔排出，排出的冷空气由饱和蒸汽取代，利用蒸汽释放的潜热使物品达到灭菌。2.1.2.2 预真空压力蒸汽灭菌器利用机械抽真空的方法，使灭菌柜室内形成负压，蒸汽得以迅速穿透到物品内部进行灭菌。蒸汽压力达205.8kPa（2.1kg/cm2），温度达132或以上，开始灭菌，到达灭菌时间后，抽真空使灭菌物品迅速干燥，根据一次性或多次抽真空的不同，分为预真空和脉动真空二种，后者因多次抽真空，空气排除更彻底，效果更可靠。2.1.2.3 压力蒸汽灭菌器的使用具体操作步骤、常规保养和检查措施，应按照厂方说明书的要求严格执行。2.1.3 灭菌前物品的准备2.1.3.1 清洗：灭菌前应将物品彻底清洗干净，物品洗涤后，应干燥并及时包装。2.1.3.2 包装包装材料应允许物品内部空气的排出和蒸汽的透人。事售普通铝饭盒与搪瓷盒，不得用于装放待灭菌的物品，应用自动启闭式或带通气孔的器具装放；物品捆扎不宜过紧，外用化学指示胶带贴封，灭菌包每大包内和难灭菌部位的包内放置化学指示物。2.1.3.3 装载（1）下排气灭菌器的装载量不得超过柜室内容量80%；预真空灭菌器的装载量不得超过柜室容积90%，同时预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌器的装载量又分别不得小于柜室容积的10%和5%，以防止“小装量效应”，残留空气影响灭菌效果。（2）应尽量将同类物品放在一起灭菌，若必须将不同类物品装放在一起，则以最难达到灭菌物品所需的温度和时间为准。（3）物品装放时，上下左右相互间均应间隔一定距离以利蒸汽置换空气；大型灭菌器，物品应放于柜室或推车上的铁丝网搁架上；无搁架的中小型灭菌器，可将物品放于铁丝蓝中。（4）难于灭菌的大包放在上层，较易灭菌的小包放在下层；金属物品放下层，织物放上层，物品装放不能贴靠门和四壁，以防吸入较多的冷凝水。（5）启闭式筛孔容器，应将筛孔的盖打开。2.1.4 灭菌后处理2.1.4.1 检查化学指示胶带（指示卡）变色情况，未达到或有可疑点者，不可使用；2.1.4.2 已灭菌的物品，不得与未灭菌物品混放；合格的灭菌物品，应标明灭菌日期；2.1.4.3 每批灭菌处理完成后，应记录灭菌物品包的种类、灭菌温度、作用时间和灭菌日期与操作者等。有温度，时间记录装置的，应将记录纸归档备查。2.1.5 注意事项2.1.5.1 采用湿热灭菌，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。2.1.5.2 湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。2.1.5.3 完全排出高压灭菌器内的冷空气，在高压蒸汽灭菌时，为保证达到规定的温度，必须将冷空气完全排出。否则，虽然压力达到，而温度达不到规定的要求，灭菌就不彻底。2.1.5.4 要注意被灭菌物品的温度，灭菌器内温度与被灭菌药品温度之间的关系：两者之间的温度一般是一致的，但亦有不一致之时。不一致的情况多发生于蒸汽输入过快而温度上升较慢。2.1.5.5 高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易染菌，取出后应置恒温培养箱（或干燥箱）中烘干，待用。2.1.5.6 灭菌设备应在使用时每日检查一次，检查内容包括：（1）检查门框与橡胶垫圈有无损坏、是否平整、门的锁扣是否灵活、有效。（2）检查压力表在蒸汽排尽时是否到达零位。（3）由柜室排气口倒入500ml水，查有无阻塞。（4）关好门，通蒸汽检查是否存在泄漏。（5）检查蒸汽调节阀是否灵活、准确、压力表与温度计所标示的状况是否吻合，排气口温度计是否完好。（6）检查安全阀是否在蒸汽压力达到规定的安全限度时被冲开。（7）手提式和立式压力蒸汽灭菌器主体与顶盖必须无裂缝和变形；无排气软管或软管锈蚀的手提式压力蒸汽灭菌器不得使用。（8）卧式压力蒸汽灭菌器输入蒸汽的压力不宜过高，夹层的温度不能高于灭菌室的温度。（9）预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌器每日进行一次B-D（Bowie-Dick Test）测试，检测它们的空气排除效果。2.2 干热灭菌法本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。2.2.1 适用范围适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌物品的灭菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石腊等均可采用本法灭菌。2.2.2 操作方法2.2.2.1 灼烧与火焰灭菌：灼烧主要是用于接种工具灭菌，如接种针、刀、剪等在火焰上灼烧即可达到彻底灭菌，火焰灭菌通常用于无菌操作中，将试管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反复通过火焰数次，利用火焰对管口等进行灭菌。阻止管口污染，作为无菌操作过程中的辅助灭菌手段，故其效果与灼烧灭菌并不完全等同。但烧灼对器材损坏性大。此外，污染的纸张、棉花和实验动物的尸体等等可用焚烧灭菌。2.2.2.2 干烤灭菌：利用热辐射及干热空气进行灭菌，多采用机械对流型烤箱，一般将待灭菌的物品，例如剪刀、镊子、不锈钢药匙、注射器、平皿、试管、乳钵等金属、玻璃、陶瓷制品包装后均可在烤箱内干热灭菌。通常加热至160，保温2h可完全灭菌。25045min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内霉素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。2.2.3 注意事项2.2.3.1 待灭菌的物品干热灭菌前应洗净，防止造成灭菌失败或污染炭化；玻璃器皿灭菌前应洗净；灭菌时勿与烤箱底部及四壁接触，灭菌后不宜降温过速，骤冷易引起玻璃器皿炸裂。2.2.3.2 采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。物品包装不能过大，物品不能超过烤箱高度的2/3,物品间应留有充分的空间（可放入一只手）。2.2.3.3 温度不宜超过170，因包装用纸张或棉织物容易焦化，玻璃量具也易变形。2.2.3.4 干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准及确定最冷点位置等。2.3 辐射灭菌法本法系指将灭菌物品置于适宜放射源辐射射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。最常用的为60Co-射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可本法灭菌。但因安全性原因，60Co-射线辐射灭菌在实验室应用较少。紫外线是光谱中对生物危害最大的部分，亦是一种电磁辐射。它使DNA的嘧啶基之间产生交联，成为二聚物。抑制DNA的复制，导致突变或死亡。细菌芽孢较繁殖体对紫外线有较强的抗性。紫外线消毒操作方便，杀菌谱广，但穿透力弱，影响因素多，杀菌效能受到一定限制。2.3.1 紫外线消毒适用范围及条件2.3.1.1 微生物污染的表面、水和空气均可采用紫外线消毒。2.3.1.2 消毒时必须使消毒部位充分暴露于紫外线。用紫外线消毒纸张、织物等粗糙表面时，要适当延长照射时间，且两面均应受到照射。紫外线消毒的适宜温度范围是2040，温度过高过低均会影响消毒效果，可适当延长消毒时间；用于空气消毒时，消毒环境的相对湿度应低于80%，否则应适当延长照射时间，用紫外线灭杀被有机物保护的微生物时，应加大照射剂量。空气和水中的悬浮粒子也可影响消毒效果。2.3.2 紫外线消毒灯和紫外线消毒器2.3.2.1 目前我国使用的紫外线消毒灯有下述几种：（1）普通直管热阴极低压汞紫外线消毒灯：由于这种灯在辐射253.7nm紫外线的同时，也辐射一部分184.9nm紫外线，故可产生臭氧。（2）高强度紫外线消毒灯：要求辐射253.7nm紫外线的强度（在距离1m处测定）为：功率30W灯，170W/cm2；11 W灯，40W/cm2。（3）低臭氧紫外线消毒灯：热阴极低压汞灯。可为直管型或H型，由于采用了特殊工艺和灯管材料，故臭氧产量很低，要求臭氧产量1mg/h。（4）高臭氧紫外线消毒灯：由于采取了特殊工艺，这种灯产生较大比例的波长184.9nm的紫外线，故臭氧产量较大。2.3.2.2 紫外线消毒器（1）紫外线空气消毒器：采用低臭氧紫外线杀菌灯制造，可用于有人条件下的室内空气消毒。（2）紫外线表面消毒器：采用低臭氧高强度紫外线杀菌灯制造，以使其能快速达到满意的消毒效果。（3）紫外线消毒箱：采用高臭氧高强度紫外线杀菌灯或直管高臭氧紫外线灯制造，利用紫外线和臭氧的协同杀菌作用，同时利用臭氧对紫外线照射不到的部位进行消毒。2.3.3 紫外线消毒使用方法2.3.3.1 对物品表面的消毒：（1）照射方式：最好使用便携式紫外线消毒器近距离移动照射，也可采取紫外灯悬吊式照射，对小件物品可放紫外线消毒箱内照射。（2）照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10000Ws/cm2；杀灭细菌芽孢时应达到100000Ws/cm2；病毒对紫外线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽孢之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要照射到600000Ws/cm2，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细菌芽孢弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100000Ws/cm2。辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强度和照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算出需要照射的时间。例如，用辐照强度为70W/cm2的紫外线表面消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是100000Ws/cm2，则需照射的时间是：100000Ws/cm270W/cm2=142924min2.3.3.2 对室内空气的消毒：（1）间接照射法：首选高强度紫外线空气消毒器，不仅消毒效果可靠，而且可在室内有人活动时使用，一般开机消毒30min即可达到消毒合格。（2）直接照射法：在室内无人条件下，可采取紫外线灯悬吊式或移动式直接照射。采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（30W紫外灯，在1.0m处的强度70W/cm2）的数量为平均每立方米不少于1.5W，照射时间不少于30min。2.3.4 注意事项2.3.4.1 要求用于消毒的紫外线灯在电压为220V、环境相对湿度为60%、温度为20时，辐射的253.7nm紫外线强度（使用中的强度）不得低于70W/cm2，测定的距离：普通30W直管紫外线灯在距灯管1m处测定，特殊紫外线灯在使用距离处测定；使用的紫外线测强仪必须经过标定，且在有效期内；使用的紫外线强度检测指示卡，应取得卫生许可批件，并在有效期内使用。2.3.4.2 紫外线灯使用过程中其辐射强度逐渐降低，故应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下时，应及时更换。在使用过程中，应保持紫外线灯表面的清洁，一般每两周用酒精棉球擦拭一次，发现灯管表面有灰尘、油污时，应随时擦拭。2.3.4.3 用紫外线灯消毒室内空气时，房间内应保持清洁干燥，减少尘埃和水雾，温度低于20或高于40，相对湿度大于60%时应适当延长照射时间。2.3.4.4 用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。2.3.4.5 不得使紫外线光源照射到人，以免引起损伤。2.3.4.6 紫外线强度计至少一年标定一次。2.4 气体灭菌法本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法，常用的化学消毒剂为环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等，本法适用于在气体中稳定的物品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。本分钟最常用的气体是环氧乙烷，一般与80%90%的惰性气体混合使用，在充有灭菌气体的高压腔室内进行。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用。采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌结果的重要因素。可采用下列灭菌条件：温度（5410）相对湿度（6010）%灭菌压力8105Pa灭菌时间90min灭菌条件应于验证。灭菌时，将灭菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并对灭菌物品中的环氧乙烷残留物和反映产物进行监控，以证明其不超过规定的浓度，避免产生毒性。采用环氧乙烷灭菌时，应进行泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性。灭菌程序确认时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中物品的排列方式对灭菌气体的扩散和渗透的影响。2.5 过滤除菌法本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌。除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种，滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。除菌滤器及滤膜应符合无菌检查法标准操作规范的要求。3 生物指示剂不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特征：3.1.1 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。3.1.2 菌种应无致病性。3.1.3 菌株应稳定。存活期长，易于保存。3.1.4 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。3.2 生物指示剂的制备3.2.1 生物指示剂的制备应按一定的程序进行，需先确定所用微生物的特征，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）等。菌株应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。3.2.2 生物指示剂中包含一定数量的一种或多钟孢子，可制成多种形式通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。D值除与灭菌条件相关外，还与微生物存在的环境有关。因此，一定形式的生物指示剂制备完成后，应测定D值和孢子总数。生物指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。载体和包装材料在保护生物指示剂不致污染的同时，还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触。载体和包装的设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。3.2.3 有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。3.3 生物指示剂的应用3.3.1 在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。3.3.2 可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的D值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。3.3.3 在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂直接接触被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。3.3.4 过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生物工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验证所获得的数据进行评估。3.4 常用生物指示剂3.4.1 湿热灭菌法 湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953）。D值1.53.0min，每片（或每瓶）活孢子数51055106个，在121、19min下应被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子（Spores of Clostridium sporogenes如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955），D值为0.40.8min。3.4.2 干热灭菌法 干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis，如NICMB8058、ATCC9372）。D值大于1.5min，每片活孢子数51055106个。去热原验证时使用大肠埃希菌内毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000细菌内毒素单位。3.4.3 辐射灭菌法 辐射灭菌法最常用的生物指示剂为小芽孢子（Spores of Bacillus pumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142）。每片活孢子数107108，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小