微生物在药物开发中的应用.doc

微生物在药物开发中的应用胡海峰,朱宝泉上海医药工业研究院生物制药部,上海200040【摘要】微生物在药物的开发中具有十分重要的作用,主要表现在微生物(细菌,放线菌,真菌等)的次级代谢产物具有结构多样性,活性广泛性和临床有效性,其中许多化合物或其衍生物已经成为临床治疗多种疾病的药物;微生物产生的酶具有反应条件温和,立体选择性强和效率高的优点,也成功地应用于甾体药物和手性药物的合成中,部分酶蛋白也直接成为治疗药物微生物对药物开发的贡献巨大,仍然值得进一步发掘其潜力【关键词】微生物药物;酶;生物转化【中图分类号】TQ460.38【文献标识码】A【文章编号】16723651(2006)【)30168.04微生物是与人类关系密切的一类微小生物体,具有种类的多样性和功能的复杂性,一些能够引起人类的多种疾病(称之为病原微生物),一些则对人体无害且有益(如肠道内生菌).在药物的研发中,某些微生物发挥了十分重要的作用,特别是微生物药物,主要由微生物完成药物的全合成,具有条件温和,环境污染小和易工业化放大生产等优点.本文主要介绍上海医药工业研究院生物制药部近年来在药物研发中与微生物应用有关的研究方法和实例,对微生物在药物开发中的应用进行展望.1微生物药物的开发微生物药物的研发主要包括两个方面,一方面指微生物新药的研发(创新药物),另一方面为微生物仿制药的研发(仿制药物).尽管创新药物研究价值和意义巨大,但其高风险,高投入和长周期阻碍了全面开展的可能性;仿制药不仅在发展中国家具有现实可行性,在发达国家仍然存在以仿制药研发为特色的制药企业.作者认为两者应该共存和协调发展,在不同的发展阶段,侧重点有所不同.结合本院的实际介绍两个方面的研究.1.1微生物新药微生物新药的研究在上海医药工业研究院开【收稿日期】2006.05.08【基金项目】上海医药工业研究院创新基金【通讯作者】胡海峰:研究员,上海医药工业研究院生物制药部副主任,Tel:021.6289726,E-mail:haingyahoo,COInl68Ch.,NatMedMav2006Vol,4No,3展了几十年,研究工作包括:分离大量土壤和海洋微生物菌株(约5万株),先后使用十几个模型筛选活性菌株(几百株),分离与鉴定一些活性化合物(4个以上新化合物),发表几十篇相关文章.在此研究方面,先后与日本麒麟啤酒公司合作开展抗肿瘤和免疫抑制活性药物的筛选,与辉瑞制药研究所开展高温放线菌的筛选,与日本东京微生物化学研究所开展长期的微生物天然产物研究.伴随着中国的体制改革,市场化的趋势进一步加强,微生物新药的研究受到挑战,不得不寻找新的发展方向以维持生存.食用真菌多糖的发酵开发具有方向明确,风险较小的特点,希望获得一些创新药物.本实验室发现了一些微生物天然产物,其中SIPI一20-2化合物为新结构化合物,具有中等强度的免疫抑制活性;化合物SIPI一100-2表现出较强的抗肿瘤活性,结构已经报道;化合物SIPI一1140-8(QuinomycinC)和10(QuinomycinA)表现出强的抗MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)活性,文献报道其抗肿瘤活性和毒性偏大;化合物SIPI一7631I(toyocamycin)为核苷类抗生素,具有抗真菌活性;化合物SIPI一8915表现出强的免疫抑制活性,比环孢菌素A活性强,但毒性偏大,没有开发的价值(图1).在现有的条件下,开展真菌多糖的研究十分必要,特别是临床上使用的药用真菌.本实验室与中药研究室合作开展紫灵芝发酵抗肿瘤活性部位的筛选,取得较好成绩,发现一种紫灵芝发酵的胞内多糖具有比灵芝固本散药品更强的抗肿瘤活彳脚天然物2006年5月第4卷第3期性,目前正在进行新药开发.利用微生物技术开发药用真菌多糖不仅可以选育菌种,还可以优化发酵工艺,达到活性的最佳化;与人工栽培相比,具有利于产业化和重现性好的优点.暾M.图1几个化合物的结构式1.2微生物仿制药微生物仿制药的研发已经成为发展中国家药物研发的重点,尽管我国在十一五规划中强调创新药物,但有限的投入和市场化机制仍然制约创新药物的发展,仿制药研发仍然具有较大的市场需求.本院在仿制药研发方面取得较好成绩,近几年先后开发成功的微生物药物有:免疫抑制剂麦考酚酸酯,雷帕霉素和他克莫司,抗感染药物万古霉素,杆菌肽锌和那他霉素,抗肿瘤药物丝裂霉素C,博来霉素等.其他一些品种正在开发中,也将陆续与企业合作实现产业化.微生物仿制药的研发主要环节包括菌种的选育,发酵工艺优化,提取与精制工艺的研究等,部分产品需要进行新药申报,增加质量研究和中试放大研究的内容.在这些研究中需要使用一些常规技术并采用新技术,以下介绍相关的技术与方法.1.2.1菌种选育开展微生物仿制药的研发,出发菌种一般单位较低,不适合产业化研究,因此菌种选育是第一项研究任务,决定着项目的成败.目前使用的方法主要为传统方法如紫外和NTG诱变结合大量筛选.尽管工作量大且筛选具有盲目性等缺点,但效果是可以肯定的.伴随着其他学科寸崮天然睡物2006年5月第4卷第3期HO的发展,一些新的方法也应用到菌种选育中,如核糖体工程技术,微波诱变技术,底物类似物抗性技术等.如多杀菌素的产生菌(刺糖多孢菌SP一29)菌种选育,根据核糖体工程技术,筛选sP一29菌株抗作用于核糖体的安谱霉素突变株,获得A106高产的突变株;进而使用多杀菌素大环内酯结构类似物一红霉素进行抗性筛选,获得AE824高产菌株;再使用多杀菌素前体一鼠李糖进行抗性筛选,获得高产突变株AER332菌株;最后筛选底物葡萄糖的结构类似物一2一脱氧葡萄糖的抗性突变株,获得AERD17高产突变株(图2).1.2.2发酵工艺发酵工艺研究主要包括培养基优化和发酵条件的优化,采用的方法主要有单因素试验,双因素试验,均匀设计法和正交设计法等方法.最近有报道使用响应面方法.本院的发酵工艺研究均采用这些方法,对微生物仿制药的发酵工艺研究十分有效,能够不同程度提高发酵水平.除这些常规的方法以外,前体添加工艺的研究也十分重要,本实验室详细研究洛伐他汀的前体添加工艺,取得明显的效果.研究内容包括:前体对洛伐他汀生物合成的作用,有效前体的最佳添加浓度和添加时间.结果表明,柠檬酸三钠是Chin.,NatMedMav2006Vo1.4No.3169比柠檬酸铁更有效促进洛伐他汀合成的前体,其最佳浓度为0.75%,在0h添加最有效;在这些条件下,洛伐他汀的产量达9134.0mg?L,与不添加前体相比提高了26.8%.幺f小I.j上术一Apramvcm100lagml物i类似物一Er)throm5cin80gmLSI一29JA10-6l图2多杀菌素产生菌的菌种选育流程2微生物生物转化微生物生物转化是指利用生物体系,如细胞和酶等作为催化剂,实施有机合成目的的合成方法,具有传统化学合成不可比拟的优点,如选择性好,催化效率高,反应条件温和,环境友好.微生物转化提供了许多常规化学方法不能或不易完成的合成方法.甾体微生物转化已经成为微生物转化在制药工业中应用的成功典范,推动了甾体类药物的巨大发展.2.1微生物转化与新药开发微生物转化也可以应用于新药研发,如以天然活性成分为先导通过结构修饰发现新的药物.青蒿素是我国从中药中自主开发的抗疟药物,许多科研工作者都试图通过结构改造,以提高青蒿素的资源利用率.迄今已制备了数百个青蒿素的衍生物,并筛选出双氢青蒿素,蒿甲醚,蒿乙醚,青蒿虎酯及青蒿酯钠等几个高效抗疟衍生物,但是由于青蒿素的有效活性基团过氧桥的不稳定性,使得对青蒿素结构改造无法在酮基以外的部位进行,目前可用的化学改造方法都停留在对酮基的还原及对羟基的取代反应上.有研究人员从l8个菌种中筛选出1个能够催化转化青蒿素,双氢青蒿素和蒿甲醚的菌株,并对培养基进行了优化,使主产物的转化率达到56%以上.另外,从发酵17OChiHJNatMedMav2006Vo1.4N0.3毒产物中分离得到了16个转化产物并鉴定了其中14个结构,其中10个为新化合物,目前正在进行活性的筛选.2.2微生物转化与甾体药物微生物能够催化甾体进行转化的反应类型很多,原理上主要分为氧化反应和还原反应_4一,也有微生物能催化氧化和还原的混合反应.实验室主要研究2个甾药物的羟基化反应:去氢表雄酮的7和15位羟基化和坎利酮的15和11位羟基化反应.2.2.1微生物转化合成7a,15a一二羟表雄酮_6JYasmin(屈螺酮加炔雌醇)为先令公司开发成功的口服避孕药,已经在美国和欧洲上市.7a,15a一二羟基雄烯醇酮(7a,15adihydroxyandrostenolone)是合成屈螺酮的重要中间体.应用亚麻刺盘孢(Colletotrichumlini)的羟化酶系统对去氢表雄酮底物进行生物转化,合成了7a,15a一二羟基雄烯醇酮,转化采用直接转化方法和间接转化法(图3).实验结果表明,直接转化与间接转化的转化率均在60%70%,但间接转化的副产物少,提取和纯化收率高.直接转化方法简单,放大到工业化生产仍然使用直接转化法.转化机理研究发现,亚麻刺盘孢将底物的7位羟基化合成7a一羟基雄烯醇酮,再将其15位羟基化形成双羟基的产物(图3),我们分离获得中间转化产物7a-羟基雄烯醇酮,还使用中间体加料方法证实该二步转化的机理.HOOHOOHI.7a,15a一二羟基雄烯醇酮;2.去氢表雄酮;3.7a一羟基雄烯醇酮图3推测转化反应流程图本工艺已经实现产业化,发酵规模达到5000L,转化提取总收率达到55%以上水平,为Yasimi的国产化作出较大贡献.寸闰天然景物2006年5月第4卷第3期一一%一物炎物2.2.2坎利酮生物转化的研究7-S坎利酮化合物具有利尿功能和肾上腺皮质激素受体拮抗的功能,对其结构修饰和筛选获得临床治疗心血管疾病药物Eplerenone,其中关键的11位羟化反应可以由微生物转化完成.为了获得其新的结构衍生物,我们利用赭曲霉羟化酶系统对坎利酮进行转化研究,发现不同的赭曲霉羟化酶对坎利酮进行转化形成多个转化产物,包括15羟基坎利酮,11羟坎利酮和11羟6,7二氢坎利酮等化合物.对其中一株转化菌SIPI一44进行研究,分离出15一羟基坎利酮(图4),并且15一羟坎利酮的转化未见文献报道.OO图4SIPI-44菌株转化合成l5-羟坎利酮为了完成11位羟基化研究,进行不同真菌的筛选发现实验室保藏的根霉能够高效,特异性转化合成11a一羟基坎利酮,转化率可以达到80%以上,副产物较少(图5),具有产业化的良好特性,正在进行放大研究.PIodllcrubs【l:lte八024,mlI1发液t1燕耱纂2341:J物:2:发液i取十t冬1Ifl3:结一物:4:对t图5微生物转化合成llct-羟基坎利酮3微生物酶微生物可以产生种类多样,功能强大的酶资寸同足然染物2006年5月第4卷第3期源,除了应用于微生物转化的酶系外,许多酶可以直接被应用于临床.因此,研究与开发微生物酶资源也是药物研发的一个重要组成部分.本院原生化研究项目如胶原酶(一类新药)和链激酶(溶血栓的二类新药)均采用细菌发酵法生产,以取代动物脏器提取.微生物发酵法生产药用酶不仅成本大大降低,实现产业化放大较容易,还可以应用微生物技术优化酶的活性和提高酶的生产水平4展望微生物是十分重要的资源之一,值得药物研发工作者不断发掘其应用的潜力,促进药物研发的快速发展.尽管人类已经对微生物资源研究与开发几十年,但目前研究的微生物仅占微生物总量的1%,大量不可培养的微生物资源需要开发,特别是特殊的酶资源.因此,微生物的潜能还很大,需要充分利用和发展新的技术和方法,加快微生物在药物研发中的应用.参考文献1胡海峰(HuHF),朱宝泉(ZhuBQ),龚炳永(GongBY),等.微生物来源的免疫抑制活性物质:I.抗生素S1P1.8415的研究J.中国抗生素杂志(JinAntibiot),1998,23(2):l12.115.2崔佳佳(CuiJJ),胡海峰(HuHF),朱宝泉(zhuBO),等.微生物来源的抗真菌抗生素SIPI一7631的研究【J.中国抗生素杂志(JAmibiot),2004,29(10):577578.3李公克(LiGK),张琴(ZhangQ),江勇(JiangY),等.微生物来源的抗耐药活性化合物SIPI一1140A和SIPI.1140B的研究J.中国天然药物(ChinJMed),2004,2(3):I89192.4胡海峰(HuHF),朱宝泉(zhuBQ),张琴(ZhangQ),等微生物来源的免疫抑制活性化合物sIPII8.1和sIPI一182的研究J.中国天然药物(ChinJMed),2003,1(2):l16.119.5江勇(JiangY),伍松陵(wusL),张育杰(ZhmlgYJ),等.微生物来源的抗肿瘤活性化合物SIPI.1002的研究J,中国天然药物(ChinJNatMed),2006,4(1):7072,6尚珂(ShangK),胡海峰(HuIIF),朱宝泉(zh