聚谷氨酸发酵液菌体去除工艺研究.docx

聚谷氨酸发酵液菌体去除工艺研究杨树峰 1，楼鹏 2，李振海 2，乔长晟 1*（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津北洋百川生物技术有限公司，天津 300457）摘要：针对地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC3336 发酵生产得到的聚谷氨酸发酵液粘度高，传统的板框过滤、平板超滤等菌体分离方法分离菌体非常困难的问题，本文研究了酸化絮凝工艺进行菌体分离的可行性，研究确定了最适合聚谷氨酸发酵液菌体分离的工艺参数：利用 50%（v/v）的硫酸调节发酵液 pH 3.0，酸化絮凝 8h，经过 200L工艺放大证明，酸化絮凝除菌体是一条适合聚谷氨酸发酵分离菌体的新工艺。关键词：聚谷氨酸；酸化絮凝；分离菌体；收率中图分类号：TQ920.6文献标识码：A文章编号：1674-506X（2013）01-0013-0004Acidification Flocculation Method to Remove the Bacteria in thePGA Fermentation BrothYANG Shu-feng1， LOU Peng2， LI Zhen-hai2， QIAO Chang-sheng1*（1.Tianjin university of science & technology college of biotechnology Ltd, Tianjin 300457, China;2.Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co., Ltd All rights reserved, Ltd, Tianjin 300457, China）Abstract： Removal of the bacteria in the fermentation broth is a critical step in the process of separation and ex-traction， the fermentation broth obtained by fermentation of Bacillus licheniformis. Directly using the centrifugal method of separation of bacteria is difficult because of the high viscosity of the fermentation broth， it is necessary to find another effective alternative to centrifugal sterilization method. Parallel tests， screening out the most suitable poly glutamic acid fermentation liquid separation process parameters of the biomass， the framework of PH 3.0 acidi- fication flocculation eight hours， using 50% sulfuric acid for acidification in the acidification of sterilization， to ac- celerate the flocculation of bacteria flocculation crystal recycling fermentation residue of sodium glutamate. Proven that the process is a new technology for poly glutamic acid fermentation separation biomass.Key words： -PGA； acidification flocculation； separation； extraction yielddoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2013.01-004-聚谷氨酸 （-Poly glutamic acid，-PGA）是由一些芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、枯 草芽孢杆菌等）产生的胞外氨基酸聚合物1。聚谷氨 酸结构中具有大量的游离羧基和氢键， 因而具有很 多优良的特性，如保湿型，吸水性，具有良好的生物 可降解性和生物相容性等 4， 可被应用于食品 、 环 保、化妆品等众多领域5-6。现在，日本明智制果、味之素株式会社和台湾味丹企业已进行了 -PGA 的商业化试生产。而国内的一些高校则处在科研阶段， 天津南开大学将分离到得一株产聚谷氨酸的地衣芽 孢杆菌进行发酵，得到 11g/L 的产量7-8。高校研究中 以南京工业大学为主要代表， 其用芽孢杆菌来发酵 生产 -聚谷氨酸， 在谷氨酸添加浓度为 30g/L 时， 其产量为 14.2g/L9。但是目前国内对 -聚谷氨酸进收稿日期：2013-01-16作者简介：杨树峰（1973-），男，研究生在读。研究方向：生物发酵。* 通讯作者：乔长晟（1969-），男，博士，教授。142013 年第 1 期行产业化生产的企业还比较少， 而研究的热点又集中于微生物发酵生产，提高产量，对如何提高分离提 取收率的相关报道非常少。通过微生物发酵得到高粘度的发酵液， 可用有 机溶剂沉淀法、 化学沉淀法和膜分离沉淀法获得 聚 谷 氨 酸 10。 有机溶剂沉淀是在上清液中 加 入 醇 类有机物（ 如甲醇、 乙醇） 可沉淀得到聚谷氨酸， 而 化学沉淀是用饱和 CuSO4 溶液代替有机溶剂醇 沉， 直接利用盐析沉淀得到聚谷氨酸。 对高粘度的发酵液还可采取膜分离沉淀法10。 聚谷氨酸粗品， 将 其 复 溶 ， 活 性 炭 脱 色 ， 离心除去不溶解的杂质 ， 然后采用透析或电渗析除盐的方法就可以收集得 到精制的白色高纯聚谷氨酸产品 。 聚谷氨酸提取 精制的工艺， 第一步也是非常关键的一步就是去 除菌体， 收集聚谷氨酸上清液。 现在已有文献报道 中去除地衣芽孢杆菌方法包括离心法 ， 板框过滤 和平板超滤， 但是聚谷氨酸含量较高的发酵液粘 度极大， 简单的离心已经不能将菌体大规模有效 分离， 因此需要选择一条新的有效去除聚谷氨酸 发酵液中菌体的分离工艺。1 实验材料1.1 菌种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BCPG006，由天津北洋百川生物技术有限公司提供。1.2 培养基（1）LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0，121灭菌 20min。（2）发酵培养基 （g/L）： 葡萄糖 80， 硫酸镁 0.5，酵母膏水解液 40，NaCl 10，CaCl2 1， 谷氨酸钠 80，FeCl3 0.01，pH 7.0，121灭菌 20min。聚谷氨酸含量的测定聚谷氨酸的定量采用的检测方法是将发酵液除 去菌体，取上清在一定温度和真空度下酸解，然后用 高效液相色谱或者氨基酸分析仪（SBA）检测水解前 后的谷氨酸的含量， 水解前后谷氨酸的差量即为聚 谷氨酸的量11。1.3.3发酵液粘度的测定由于聚谷氨酸的发酵液粘度较高， 因此粘度检 测时选用小体积的 4# 转子检测更为准确。各个平行 小试阶段，量取 20mL 左右样品倒入离心管，固定在 数显粘度计下，放入 4# 转子没过液面，旋转检测粘 度。1.3.4聚谷氨酸分子量的测定11高效液相采用 0.2mol/L NaSO4，丁乙酸调节 pH4.0 作为流动相 ， 流速 1mL/min； 进样量 50L。 采用 葡聚糖作为分子量参照。2结果与讨论2.1pH 对发酵液粘度及除菌率的影响收集聚谷氨酸原始发酵液 ， 经 测 定 粘 度 为89mpa/s。各取 1L 发酵液，分别加入硫酸和氢氧化钠 溶液调节 pH 至 1、3、5、9、11，同时以 1L 原始发酵液（pH 7.0）作为对照样，充分搅拌稳定后测定粘度。以 粘度为纵坐标，pH 为横坐标绘制图 1。1.3.2140120100806040200主要仪器SBA 生物传感仪（氨基酸分析仪）：山东省科学 院生物研究所。752 紫外可见分光光度计： 天津市拓普仪器有 限公司。粘度计：上海平轩科学仪器有限公司。高效液相色谱：安捷伦；凝胶色谱柱：日本昭和 重工。1.3聚谷氨酸提取方法1.3.1聚谷氨酸提取工艺 菌种培养发酵分离菌体收集上清液上清醇沉收集沉淀复溶脱色再次沉淀干燥粉 碎聚谷氨酸产品。1.1.30246pH81012图1Fig.1聚谷氨酸发酵液在不同pH值下粘度变化图The viscosity trend of -PGA fermentation broth at different pH聚谷氨酸发酵液加入硫酸调节至 pH 5.0，充分搅拌 30min 后粘度下降为 35.8mpa/s。pH 3.0 发酵液 的粘度为 6mpa/s；pH 1.0 发酵液的粘度为 5.6mpa/s。 酸化调节发酵液粘度变化明显 ，pH 3.0 和 pH 1.0 的区别不是很大。聚谷氨酸发酵液的粘度变化对最终菌体分离的viscosity/mpa.s第 49 卷（总第 173 期）杨树峰等：聚谷氨酸发酵液菌体去除工艺研究15效果影响较大，通过离心实验平行验证不同 pH 对后发酵液静置时间为横坐标， 聚谷氨酸分子量为纵坐标绘制图 3。聚谷氨酸酸性发酵液，在 pH 3.0 的条件下静置24h 以 内 ， 聚 谷 氨 酸 分 子 量 从 1200kDa 下 降 至1050kDa，静置超过 24h， 在 32h 分子量快速下降至900kDa。 所以优化工艺后将发酵液酸化后 ， 静置时 间在 24h 内分离上清液进行分离提取。2.3无机盐对发酵液粘度及除菌率的影响由于酸化后发酵液中的聚谷氨酸分子量逐 渐 下降， 因此必须缩短酸化静置时间 。 平行试验证 明， 在高粘发酵液中加入氯化钠等无机盐可以降 低发酵液的粘度， 促进菌体分离提取。 设计平行试 验 ， 各 取 1L 原 始 发 酵 液 ， 分 别 加 入 1 -5% 的 氯 化 钠（ 质量体积比） ， 搅拌均匀后测定粘度。 以粘度为 纵坐标， 不同比例氯化钠的添加量为横坐标 ， 绘制 图 4 。发酵液离心除菌率的影响 。 取 原 始 发 酵 液 5mL，10000r/min 离心 30min， 将完全分离得到菌体烘干 称重， 以此为参照 。 取 pH 分别为 1，3，5，7，9，11 的 发酵液各 5mL，5000r/min 离心 10min， 收集菌体烘 干称重，比对完全分离菌体的重量，即可以得到不同 pH 值处理的除菌率。 以发酵液除菌率为纵坐标，发 酵液 pH 为横坐标绘制图 2。95908580757065605550100959085807570656055500246 pH81012图2 聚谷氨酸发酵液不同pH值对除菌率的影响Fig.2 Sterilization rate of -PGA fermentation broth at different pH2.2硫酸酸化对发酵液中聚谷氨酸的影响由于聚谷氨酸在强酸性条件下会逐渐水解，分 子量逐渐下降甚至最终水解至谷氨酸。 平行试验验 证在酸化过程中， 聚谷氨酸分子量的变化趋势。取5L 聚谷氨酸原始发酵液，加入 50%的硫酸溶液调节pH 至 3.0，充分搅拌后均分成 5 个平行样，分别静置8h，16h，24h，32h，40h 后取样检测聚谷氨酸分子量。原始发酵液的聚谷氨酸分子量为 120 万 Da，将酸化0%1%2%3%4%5%NaCl/%图4 聚谷氨酸发酵液加入不同比例氯化钠粘度变化图Fig.4Viscosity trend of -PGA fermentation broth withdifferent concentrations of NaCl1300120011001000900800700600500757065605501020t/h3040012NaCl/%345图3 发酵液硫酸调节PH3.0后不同静置时间聚谷氨酸分子量变化图Fig.3 Change chart of -PGA molecular weight under the fermentation broth adjustment pH3.0 with different standing time图5聚谷氨酸发酵液不同氯化钠添加量对除菌率的影响Fig.5 Effect of -PGA fermentation broth with differentamount of NaCl on Sterilization rateCell depletion/%M r/kDaCell depletion/%viscosity/mpa.s 162013 年第 1 期加入 1% 氯化钠 （ 即 1L 发酵液加入 10g 氯化钠），粘 度 由 89.0mpa/s 变 成 75mpa/s； 加 入 2% 氯 化 钠和 3%的氯化钠，发酵液粘度变化不大，粘度分别 下降至 62mpa/s 和 58mpa/s。此时， 发酵液中再加入 氯化钠，发酵液的粘度基本没有变化，因此发酵液后 期处理过程在发酵液中加入 3%（质量体积比）的氯 化钠降低粘度。图 4、图 5 分别是不同氯化钠添加量 对发酵液粘度的影响， 以及不同氯化钠添加量对最 终除菌率的影响。2.4硫酸酸化对发酵液中其他物质的影响发酵液采用 50% 硫酸酸化絮凝除菌体的过程图6最终酸化处理发酵液，醇沉干燥粉碎收集得到白色聚谷氨酸样品Fig.6 Collection of -PGA中， 发现调节 pH 的试纸上析出大量细碎的晶体。收集晶体溶解后检测发现该物质是谷氨酸钠 （ 见 图 6）。经实验证明，谷氨酸钠的等电点为 3.2，用硫 酸 酸 化 发 酵 液 pH 至 3.0 会促使谷氨酸钠结晶析 出， 这样可以在发酵液去除菌体的同时回收发酵 液中残余的谷氨酸钠。 同时由于盐酸中的氯离子2Choi Hyuk Joon， Masao Kuniokal Preparation condi-tions and swelling equilibria of hydrogel prepared by -irradiation from microbial poly （-glutamic acid） J. 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