分子实验总结.doc

实验一、植物基因组DNA的提取原理:用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RNase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。注：真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出DNA，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。注意事项： （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。1、所用耗材洗净后使用，防止DNA的交叉污染。2、植物材料尽量选用幼嫩组织，材料保存要在-80下。3、所用器皿-20预冷，材料剪下后立即放到液氮中。4、研磨要充分，切勿干磨，保持材料的超低温状态。5、加酒精沉淀时要迅速混匀，减少DNA与杂质的共沉淀。6、氯仿/异戊醇应在通风橱内操作。7、提取液的pH值要调准确。思考题：1、 提取的DNA，用TE溶解不了怎么办？（1）蛋白没有除干净：在转移上清的时候不要吸的那么彻底，尽量不要把沉淀吸上来。多用苯酚除除蛋白，不溶解肯定是杂质是蛋白。（2）DNA量很大，加的TE太少，完全溶解不了。2、实验结果如何，是否达到了预期的效果，和传统的有机提取是否有优越性？ 根据材料的特点选用合适的提取方法。 纯净的DNA为白色纤维状。若带有颜色，则是有少量色素分子附着，70%乙醇能洗去部分杂质。 转移上清时，不要吸到中间层的杂质。 加RNase将RNA降解，电泳时看不到RNA片段。纯度高的DNA在适量TE中较易溶解，否则杂质含量太高。完整性好的DNA电泳图上显示一条亮带，下部无拖尾现象实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取原理：质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性条件下，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性条件下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA。NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molL NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA注意事项：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！1.提取过程中应尽量保持低温。 2. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80 1小时),使DNA酶失活。实验三、 PCR基因扩增技术原理：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。步骤：(1) 94预变性5min，(2) 94变性1min， (3) 52 退火1min，(4) 72 延伸1min。(5) 重复(2)-(4)30次(6) 72 延伸1min。（7）-20保藏思考题：1、 降低退火温度，延长变性时间对反应有何影响？变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。非特异性条带数增多。2、 PCR循环次数是否越多越好？循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。3、 如果出现非特异性条带，可能有哪些原因？一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法 (93变性， 65左右退火与延伸 ) 。4、 根据实验你觉得PCR扩增中最可能出现什么问题？ 假阳性扩增：在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源。 假阴性扩增：连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性。 扩增产物拖尾 ： 有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关： 扩增系统不完善： 模板处理方法不完善： 引物设计不合理。 产物电泳单萤光带及多萤光带：5、 影响PCR实验结果的因素有哪些？ 1、 温度循环参数：1模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。2引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。3引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度；4循环次数常规PCR一般为2540个周期。2、 引物引物设计：1引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。2（G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。3、 DNA聚合酶：4、 影响PCR特异性的因素：退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。模板中如果存在次级结构。5、 扩增平坡。实验四、琼脂糖凝胶电泳原理：1、DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 2、在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。3、共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 思考题：1、琼脂糖电泳分离质粒DNA的原理是什么？可将质粒DNA分为哪些构型？实验五、离心柱试剂盒快速纯化回收DNA片段 原理：利用DNA在低pH、高盐的情况下，能与玻璃珠特异结合的特性，低盐高pH值洗脱，达到分离DNA的目的。思考题：1、 溶液的pH对DNA回收有何影响？不同的pH值对DNA分子结构包括磷酸骨架基团,脱氧核糖及碱基都有影响. 随着酸性的增强, DNA的构型也发生变，双螺旋结构遭到破坏,而脱氧核糖也受到不同程度的损伤。2、溶液的离子浓度对回收有何影响？高盐能促进玻璃奶对DNA的吸附，所以跑胶时最好用TAE，原因是高盐可以降低Agarose熔点，促进之后的DNA 吸附。实验六、E. coli感受态细胞的制备原理：细菌在0 CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。思考题：1、 制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？为什么？首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和。1 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml）；2 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比。实验七、重组DNA的酶切分析 原理：型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。实验八、DNA重组 原理：在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子；质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。思考题：1、 影响转化效率的因素有哪些？1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 107/ml ）；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；二、白色菌落出现的原理是什么？当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落实验九、外源基因的诱导表达原理：外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。思考题：1、 IPTG的作用原理是什么？IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）是乳糖操纵子的诱导物，将其加入到培养基后，能够与lacI产生的阻遏蛋白结合，使转录酶能够顺利通过操纵基因，外源基因大量转录并高效表达。 2、为什么要增加抗菌素的用量？携带载体的菌体在正常情况下，由于自身保护作用，会丢失载体，含有载体的菌体由于代谢负担过重，比生长速率小于空载菌体！含有载体的菌体在表达外源基因的同时，也能表达AMP分解酶类。此类酶可以分解青霉素，降低危害。不含质粒的菌体则无此功能。当菌体接种量很小的时候，不带质粒的菌体生长迅速，很快成为优势菌株，当加入足够量AMP时，就具有选择压力，抑制不带质粒的菌体生长，使得含质粒菌体在种群中占有优势。实验十、SDS-PAGE检测表达蛋白原理：外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。思考题：1、 影响表达的因素都有哪些？1. 外源基因的表达效率：启动子的强弱核糖体结合位点的有效性SD 序列和起始密码子 AUG 的间距密码子组成。尽量避免使用罕用密码子；2. 表达质粒的拷贝数和稳定性：利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合到染色体中去的载体 等待方式，可以增加表达质粒的稳定性。3 表达产物的稳定性：组建融合基因