琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制.ppt

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,制作人：万倩 吴雪 李建勋 张沛露 范鎏,问题：,琥珀酸脱氢酶是哪个代谢途径中的酶，该酶位于细胞的什么部位？催化什么化学反应？实验方案是如何设计检查该酶的活性状况？,何为竞争性抑制？本次试验中选择的抑制剂是什么？如何设计实验方案检测该酶被抑制的程度？,实验目的：,1,学习动物的处死与组织匀浆的方法,2,3,学习离心机的使用方法,进一步理解酶的竞争性抑制原理,离心分离的原理： 将处于悬浮状态的细胞，细胞器，病毒和生物大分子等称为“颗粒”，每个颗粒都有一定大小，形状，密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和方向有关。,实验原理：,竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活性。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及于底物的相对比例。,草酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放能量。在体外则可用甲稀兰作为受H体，甲稀兰接受琥珀酸脱下的2H而被还原为甲白，由蓝色变为无色。在甲稀兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活性，因此，可以依据蓝色消退的时间来判断该酶活性被抑制的程度。,琥珀酸在琥珀酸脱氢酶作用下脱氢生成延胡索酸，FAD接受两个氢原子生成FADH2，然后再将氢传递给CoQ，生成CoQH2，此后的传递和NADH氧化呼吸链相同,注：,8,器材：,试剂：,小白鼠，研钵，手术剪，手术镊子，2ml移液管，10ml离心管，低速离心机,pH7.4磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲稀兰溶液 生理盐水,实验试剂与器材,实验操作,肝糜液的制备： 用颈椎脱臼法处死小白鼠，立即剖腹将肝脏全部取出，用生理盐水洗净肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml，搅拌后离心约5分钟（3000rpm）,将上清液倒入另一试管钟备用，此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。,另取5支试管，标号，按下表操作,操作：,摇匀，静置于37的水浴中，注意观察各试管的颜色变化。记录各管颜色消退的顺序和时间，并进行分析。,注意事项：,肝脏一定要充分研磨至糊状，以使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液中。离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重量相同的离心管对称放置。（用天平精密平衡离心管和它们的内容物，若有套筒，离心管应与套筒一起平衡，否则轻者造成离心机损坏，重者会引起人员伤亡）（平衡后应对称放置，不能错位，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴）离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不能震荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊。反应开始后，反应液必须静止，不能再摇动。,思考题:,（1）为什么反应开始后，反应液必须精致，不能再摇动？（2）本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶?本实验成功的关键是什么？（3）抑制剂还可以选用什么物质？（4）本实验在设计上存在着某些缺陷，指出存在的缺陷与改进方案。,临床意义：,琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（marker enzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标