动物实验设计、结果分析和解释

动物实验设计 结果分析和解释 Forscientific ethicalandeconomicreasons itisimportanttodesignanimalexperimentswell toanalyzethedatacorrectly andtousetheminimumnumberofanimalsnecessarytoachievethescientificobjectives 良好的动物实验设计对提高研究工作质量 所写的论文被高水平的杂志接受发表都非常重要 目前在生物医学研究领域的动物实验方面还存在不少低质量的研究工作 一方面是所用动物的质量不高 级别低给实验结果的科学性带来不小的影响 另一方面研究人员在实验设计和统计学分析方面的训练不足 也是导致研究工作质量低下的重要原因 一个好的实验设计 对统计学分析来说帮助很大 可以使问题变得更容易解决 而一个不正确的实验设计 可能使我们不能从实验结果中提炼出任何有用的信息 另外通过良好的实验设计和统计学方法也可减少动物使用数量 对满足动物实验的伦理性和经济性要求也有重要的意义 一般来说 动物实验的研究工作应该明确描述 研究的目的和 或者需要验证的假说 选择特定动物模型的原因 动物种 品系 来源和类型 每个独立实验步骤的详细描述 包括研究设计和使用动物数量 数据分析所用的统计学方法 一 动物实验的分类1 确证性的实验 用一种最大可能 正确解答问题的系统方法 收集有关处理实施后动物反应的科学数据 2 探索性的实验 为产生新的假说提供素材 这两类实验都涉及在实验人员的控制下 对动物施加一定的处理或操作 来发现是否处理在实验对象上引起一定的反应 或者对这种反应进行定量 3 检验性实验 是观察性的实验 用于发现科研人员不能控制的变量之间的联系 这种联系可能是暂时的也可能是长期的 实验设计的主要目的一是保证所测变量的任何差异是由处理造成的 而不是其他非对照变量引起 另一个目的是通过控制确定的变量在尽可能小的范围内 减少所测反应的变异性 这样对处理效应的评介更准确 有机体的形态行为特征要适应环境 正是适应导致有机体产生个体之间的差异 因而 动物的适应性的倾向对一个精确的实验设计来说是不可回避的挑战 我们知道 生物医学的观察是在可变的一个背景上进行的 而且 这个可变的背景比起传统的物理化学实验所遇到的要大的多 一方面是由于生命形式的化学过程 代谢 非常复杂 另一方面是动物对环境影响的积极适应 从遗传学方面讲动物的稳定性也是较差的 一般用一群群体内存在较大差异的动物进行实验 要检测到我们感兴趣的目的生物学变化 就必须用大量的动物进行实验 二 差异的分类和控制1 实验者带来的差异实验者带给实验的差异主要有两种 一是 与正确恰当的实验操作有关 如 注射 灌胃口服 外科手术等 二是 缺乏准确的测量手段 对第一种原因产生的差异 其控制应以确保实验过程和操作的一致性 准确性和完整性为目的 对第二种原因产生的差异 其控制的主要方法就是对观测数据进行多次测量 例子 动物注射给药动物的抓取固定操作外科手术 不准确的测量测量仪器本身的不准确观察的不准确GLP是1970sFDA制定的实验操作标准 保证用于药品登记的实验数据可信准确 这种基于通过工作质量的保证实现实验数据信息可信准确的思想 为全球公认接受 GLP观念的引入明显减少了科学研究工作中测量方法产生的差异 2 动物带来的差异1 动物的来源的差异2 动物饲养管理的差异3 生活在不同的环境4 健康状况不同5 动物之间相互作用引起的差异 1 动物来源的差别由于遗传漂变可能来源于不同供货商的动物存在遗传学的差异 随后由于饲养的环境方面的差异造成表型上的差异 加之 目前还没有两个供货商是采用完全一样的饲养管理程序或完全一样的饲养环境 而动物在产后的发育阶段是行为类型发育的敏感期 决定成年后保持行为类型和社会相互关系 因此有必要把动物来源的因素考虑到实验的设计中 并采用适当的控制手段检查是否还应延长时间让动物适应实验环境 2 动物饲养管理的差别动物饲养管理方面的微小变化会对动物的行为 生化和生理产生就巨大的影响 如 在其他环境条件恒定不变的情况下 只改变饲养人员就可使小鼠的繁殖性能显著下降 猜想这些影响群体性能的原因与视觉 听觉或嗅觉有关 因此明智的做法是保证动物在新的环境和更换饲养人员的情况下 至少让动物适应调整1周 才能开始实验 3 生活在不同的环境动物对其生活的环境是敏感的 一个微小的变化都可以影响到它们的行为和生理学 这里我们强调的是动物所占据的空间 微环境的差别 例如 与进风口和排气口的相对位置不同 垂直位置不同 会造成物理 化学和微生物组成的空间差异 这些情况我们在进行实验设计时也应加以考虑 4 动物健康状况临床疾病会引起明显的疾病症状 患病的动物是不能用来做实验的 而亚临床疾病不表现出疾病症状 不容易判断它是否存在 它主要的影响有二 一是 疾病可能影响特定的器官 抑制它们的功能 改变动物的生理和生化状态 如果这一功能是实验过程的测定结果时 那么实验结果很可能产生偏差 二是 亚疾病从广义上讲 对动物的健康造成不利影响 使动物对研究的操作影响变得敏感 感染带来的更大问题是疾病的严重程度根据动物的体质而变化 因此在实验的整个动物群体中差别被加大 5 动物之间相互作用引起的差异A 动物是群居还是独居要根据动物种属的行为学特性而定 实验前应了解所使用动物对群居的忍耐方式的不同 如 地鼠是独居动物 在实验条件下不适合群居生活 而小鼠的大多数品系独居是一种应激情形 3 5只小鼠最佳 或独居的动物给予一定的丰富生活的物品 遮掩物和玩具 可降低应激情形 B 动物社会阶层的建立 会影响到实验的数据的差异 另外还要考虑动物建立社会等级的过程中 存在相当高的侵略性 群体中因而引起持续的应激和明显影响动物行为学 生理学和生化特征的情况 实验前将动物分组群居时 让动物等级社会完全建立稳定再进行实验处理是十分必要的 人员培训的重要性1 了解动物饲养管理的基本知识 2 规范操作减少动物紧张和痛苦水平 3 随机化的处理安排减少处理动物对随后动物处理的困难和带来实验数据差异 一个有效减少由于不专业操作带来的结果差异的方法是在单位建立专业化的中心设施和部门 由专业化的操作能手代替研究者进行操作 SHEFFIELD大学进行小鼠免疫的例子 三 实验设计的步骤1 开始阶段1 文献查阅2 科研方法3 陈述问题 目标和假说4 动物模型的确定5 实验人员的确定 1 文献查阅查阅的文献应广泛包括现在和过去的杂志以及网络上的信息资源 如 MEDLINE TOXLINE PUBMED NCBI等 目的是了解清楚你所研究的焦点问题都已知道些什么 明确所用的方法 动物模型 排除不必要的重复研究 也是为IACUC审查提供项目不是重复研究 替代动物实验的方法不可行 可能引起动物疼痛的操作已得到评估认可的证据 2 确立科研方法1观察和描述实验中的现象 2系统地提出问题的解释和学说 3利用学说预测新的观察结果 4验证学说 3 问题的提出明确提出问题 目标和可能的结果十分关键 提出的问题应包括实验将要说明的问题和它的意义 目标应该对总目标有一个概括性的描述 对特殊的问题加以阐明 应对每一个实验方案有两个清晰的可能的结果 如 一个无效 一个预期 无效结果明确两实验组间没有差别 预期结果表明在实验组之间有真实的差别 例子 提出问题 那种饲料引起大鼠体重增加 是饲料A还是B 无效 各组实验预期得到同样结果 即大鼠用饲料A和B体重增加相同 预期 实验组之间预期出现不同的结果 不可检验 结果不容易明确或解释 4 动物模型的确定为实验选择最适当的动物模型 有以下几点建议 1使用系统发育水平最低的动物 2使用的动物具有想要的种属或品系专一的特点或者具有特定研究目的必需的特点 3考虑在实验期间得到和维持动物模型所需要的花费 4充分查阅文献 与同一领域的同事讨论 与供应商或动物模型资源库联系确定动物模型可能的来源渠道 5在最终决定动物模型前征询实验动物兽医的意见 5 实验合作者的确定根据实验实施的操作 决定什么样专长的人是需要的 在开始项目前 就确定每个人的职责和进行的工作以及资格 合理地进行人员的分工安排 参与计算 实验设计和样品收集对确保所得数据的有效性是十分重要的 一般一个大型研究单位的实验动物中心设施可提供涉及本专业高技术含量的操作和昂贵装备的服务 2 正式设计阶段1 研究方案2 实验单元3 N因子 实验组别的动物只数4 对照5 随机化 1 研究方案针对提出的问题 研究目标和假说 进行实验的所有操作及安排应细心地计划和记录在案 方案中应包括针对可控实验变量的实验操作 适合测定的变量参数 即得到准确测定实验变量控制的效应 获得样品和产生实验数据的最适方法 项目的所有实物和数据收集和测定的时间安排表都应这时确定 实际操作的讨论包括动物模型持续的时间 慢性研究 模型中预期疾病的进程 决定测定的最适时间点 人员参加项目的时间和岗位 实验花费 已知和潜在的危害因子也必须明确 最小危害因子风险适当预防措施也必须在方案中明确 所有实验操作步骤应通过SOP详细规定 方案中还应包括数据分析的方法 如果组间差异是通过统计学计算而得 那么应明确所用统计学检验的方法 由数据分析对最初所提问题作出回答并接受或否决假说 由此得出结论 2 实验单元研究的实体是实验单元 可以是一个动物个体 也可以是一组动物群体 例如 当测试药物治疗和外科手术时 一个大鼠个体就是一个实验单元 当测试环境致畸时 一整窝大鼠就是一个实验单元 3 实验组别的动物只数将适当数量的动物分配到每一个实验组别 是实验设计的一个重要环节 为了得到统计学意义的结果 每一实验组的动物数量一般是通过预期各组间结果差异的可能程度采用特定统计学检验而决定的 一个标准笼所能容纳动物的数量也是实验组动物数量确定的实际考虑的因素 4 对照过多的变量 如遗传 环境 感染因子 对动物实验的结果产生影响 因此设置对照动物消除这些外来变量或可能未知的变量带来的影响 总之 每一个实验都应使用对照组动物与实验组动物有一个直接对应的关系 对照的种类很多 包括 阳性对照 阴性对照 空白对照 媒介物对照 比拟物对照 5 随机化动物分组时必须将动物随机分配到实验各组 以确保研究的变量在各组中不会导致偏差数据 为达到随机化必须在开始时将动物群体限定好 随机化的方法常用1每一只动物有一个固定的编号 进行 暗箱 抽数 并随机分配它们到不同组中 2利用随机数字表或计算机随机程序 3 设计后阶段1 实验操作步骤的确认2 人员的确认3 小规模预实验4 数据的输入和分析5 评价 1 实验操作步骤的确认IACUC对实验操作的确认其他委员会对实验操作的确认 2 人员参加研究项目的所有人员必须经过培训和资格认可 3 小规模的预实验是使用数量少的动物得到预示性的数据 目的1通过预实验将操作和使用的技术固定完善 2预实验的数据是申请资助项目方案中证明其合理性的重要依据 增加中标的机会 3估计变量参数测定的误差 为计算样本量提供依据 4 数据的输入和分析研究者对数据的正确收集 输入和分析负有完全的责任 当处理的数据量很大时 很容易发生数据输入的错误 如组标识调换 个体标识调换 因此数据分析前 数据质量保证程序应建立并在实验设计中包含 确保数据输入的错误能及时辨别 四 对照的设立在实验中设立对照组动物 是为了与实验组动物有一个直接对应的关系 以消除过多变量和未知变量对实验结果产生的影响 对照的种类有以下几种 1 阳性对照2 阴性对照3 空白对照4 媒介物对照5 比拟物对照 1 阳性对照阳性对照的作用是作为一个标准测量各实验组间差异的程度 另一个是用来证明动物反应是可探测的 为实验方法提供质量控制 2 阴性对照阴性对照是期望正常状态不产生变化 阴性对照的目的是保证未知变量对实验组动物引起相反的效应不存在 即排除假阳性结果 3 空白对照是模拟处理组过程而实际上没有给予受试物或处理 4 媒介物对照在测试化合物溶于一种媒介时 这种研究要使用媒介物对照 与给测试物的方法一样 只给予媒介物 当与非处理的对照比较时 溶媒对照将确定溶剂是否会引起什么效应 5 比拟物对照属于阳性对照 用一个已知的的处理来对比待测处理 以此来确定新的药物或处理是否有改善和提高 五 样本大小的确定1 小规模预实验2 预期目标成功率低的实验3 验证假说的实验 1 小规模预实验小规模预实验设计是为了探索一个新的研究领域 确定是否能在不同的实验条件下对研究的变量以足够的精度测得变量值 同时检查所要进行实验的必备条件 由于前期资料信息的缺乏或实验成功的可能不能肯定 有些实验的样本大小是无法计算的 而另一些实验是将复杂的统计学设计简化成一个重要的比较事件 此时样本的大小应足够大达到可以发现统计学意义的显著差别 例子 假定一个科研人员想要确定是否X因子在炎症模型动物中水平升高 实验室已经有了测定X因子的技术方法 现在要确定的是在一群小鼠中X因子的差异 研究方案中 该科研人员设计10只动物在诱发炎症前和后测定X因子的浓度 这个预实验的结果经统计学分析可估计诱发炎症前和后X因子浓度的平均值和方差 同时可估算平均值的区别 这些估算结果可以用来为进一步的实验计算样本大小 效应大小 标准误差 SD 力度和显著性水平一般 要计算样本大小 必须提供三或四个已知因素 1 效应大小 一般为两组之间的差别 2 对连续性变量而言的群体标准误差 SD 3 测定假定效应的期望力度 4 显著性水平 前两个因素对特定实验是对应的 而后两个因素一般为惯例固定的 效应大小是研究者希望检测效应的程度必须以定量的形式陈述表示 研究的目的变量之体标准误差 SD 可以由小规模预试验的结果得到 也可以由同一实验室以前的结果或科研文献中得到 统计学分析方法如双样t检验或通过x2 卡方 比较比率的应用是由实验设计的类型决定的 为避免偏差 假定动物被随机分配到不同的测试组 饲养在相同的环境中 这时实验的力度是指实验效应被测出的概率 一般定为0 8或0 9 即科研人员在假定效应存在的情况下 有80 或90 机会发现统计学意义上的结果 而此时1减去力度的符号表示为 是指得到一个假阴性结果 false negative 的几率 即不能拒绝否定一个不真实无效假说或不能测得某特定处理效应的几率 阳性结果的规定概率即显著性水平用 表示 一般选择在0 05或0 01 换句话说 科研工作者错误表明差别 显著 而此时事实上不存在差别 的机会不会大于5 或1 一旦力度值和显著性水平选定 统计学模型 如卡方 t 检验 差异分析 线性回归 选定 然后给出研究者期望效应的的大小以及群体SD因子 就可以计算实验所用样本 动物数量 的大小 2 预期目标成功率低的实验由于实验过程成功的机会不稳定 变数太大 这类实验所用动物数量的计算是很困难的 例子 通过基因插入到受精卵或ES细胞制作转基因动物 需要大量的动物 假定所有步骤的成功率都是5 那么用单组实验的公式N log logp 计算可得要用50只动物 如果成功率为1 将需要300只动物 制作一个转基因动物系 3 验证一个假说的正式实验验证假说的实验是常见的动物实验类型 可以通过得到相关的一些有用信息 估算所需要的动物数量 一般来说 有三种类型的变量可以测定1 二分变量 一般表现为是 否结果的百分率 如 在某给定时间疾病或生存的发生 2 连续变量 如某一物质在体液中的浓度或生理功能如血流速度或排尿 3 一个事件发生的时刻 如疾病或死亡发生的时刻 这些变量数据之间的显著性差异现在有许多的统计学方法来检测 一般 要知道或计算样本大小 必须提供3或4个已知因素1 效应大小 一般为两组间的差别 2 群体标准误差 SD 对连续性变量 3 测定假定效应的实验期望力度用 表示 4 显著性水平 用a表示 前两个因素对特定实验是专一的 而后两个因素一般为惯例固定的 一般来说 研究人员希望看到差别的样本越小或群体变异性越大 观察到显著性差异的样本量一定越大 我们可以从专业网站上得到计算样本量大小的服务 www biomath info 几个计算公式 1 二分变量 比率或百分率 N C PcQc PeQe d2 2 d 22 连续变量N 1 2C s d 2用于研究比较两组的平均值 举例 二分变量 比率或百分率 这里pc是对照组中某事件发生百分率 pe是实验组中某事件发生百分率 qc 1 pc qe 1 pe d是pc和pe之间的差别 以一个正值表示 C是一个常数根据 和 选定的值而定 可通过查表而得 举一个例子 来说明该公式的应用 假如 以前的研究告诉我们 某一品系的大鼠老年时肿瘤的发生率是20 而实验设计解决的问题是是否同一品系大鼠经某化合物处理会在老年时增加肿瘤的发生率 这时假定化合物处理动物后老年时肿瘤发生率增加到50 探测到这种增加的几率为80 测试是在P 0 05的显著性水平进行 即力度为0 8 0 05 查得常数C 7 85 用公式1可计算出实验每组用动物数为31 07或约32只 总共64只动物 举例 连续变量这里S是变量的群体标准误估算值 d是研究者期望测得的差别即所说的效应水平 C是一个根据 显著性水平 和 力度 查表得到的常数 举个例子 假定在一个影响体重的实验中 大鼠在某一个年龄的平均体重是400克 SD为23克 某一减少食欲的化学物质用来进行实验以了解该化合物是否会改变大鼠的体重 同时假定研究人员在处理组和对照组之间能以90 的力度测得大鼠体重20克的减少 并且显著性水平为5 查得常数C为10 51 用双侧非配对t检验 用双侧是因为化合物也可能增加体重 可根据公式2计算出每组所用动物数量为28 8只 即大约整个实验需要用60只大鼠 30 2 六 动物实验中辅助变量的应用1 辅助变量的定义2 辅助变量在动物实验设计中的应用1 完全随机化设计2 随机化模块设计3 引入统计学分析的辅助变量4 利用辅助变量判断局外数据5 利用辅助变量评价随机化过程6 利用辅助变量评价观测的一致性7 利用辅助变量解释实验之间的差异 1 辅助变量的定义除实验中限定或主要目的反应变量外 可以收集的其他变量的总称 它与目的反应变量不一定有直接关系 包括被记录但在实验设计中不利用的变量 以及不引入到对主要实验反应变量正规分析中的变量 但往往这些记录的变量在实验的分析和解释时起到辅助的作用 记录所有观察到的变量作为实验过程的一部分 保存所有动物个体的信息作为实验记录的一部分是非常重要的 实际上 不能确定动物及其相关的个体信息会严重限制信息用于实验的可能性 2 辅助变量在动物实验设计中的应用实验设计的主要目的一是保证所测变量的任何差异是由处理造成的 而不是其他非对照变量引起 另一个目的是通过控制确定的变量在尽可能小的范围内 减少所测反应的变异性 这样对处理效应的评介更准确 1 完全随机化化设计完全随机化设计依赖于用一个保证每只动物有均等可能接受任何处理的过程 将处理分配给实验动物 处理动物的顺序也应是随机化过程的一部分 以保证所有处理动物和处理时间以及反应测量之间的差别以均等的几率散布在所有的处理组中 只有这样才有可能对实验差异和可能的偏差减少到最小 从而得到可靠的结果 但是如果实验用的动物之间本身差别就比较大 而实验用的动物数量又较少 那么随机化的过程本身就可能在组间引入了不能接受的差别 导致实验差异可能很大以至于在处理组之间不能探测到什么差别 在这个时候辅助变量 性别 体重等 的应用可以帮助我们进行组别的动物分配 达到完全随机化想要达到的目的 2 随机化模块设计分模块是为了控制一个或更多独立变量 并用来指导实验者进行一定操作的方法 这些独立的变量可能是实验用动物的特征 如性别 或窝仔 或是实验的环境因素 如 笼或架上的有效空间 实验者可以将动物分成组 模块 各组 模块 内的动物尽可能在这些特征方面一致 这种分组相关特征的选定 是根据实验者对它可能效应的知识背景而定 一般来说 社会和环境效应主要来自于群居结构 与动物的品系 年龄和性别有关 并可影响到实验结果 例如 动物可以分成雌性组和雄性组 年轻和年长组 体重大和小组 甚至 如果实验用的动物一开始就是一个均匀的单一组 如40只小鼠品系一致 年龄一致 体重在有限小的范围内 饲养的每笼数量有一定限制 如每笼饲养不能多于10只 那么笼盒就成了一个重要的变量 因为养在一个笼内的小鼠相似的方面比起与别的笼盒内的小鼠相似的更多 在同一天的同一时刻处理所有的动物或测量反应是不可能办到的 这种情况下 处理或测量的时刻就成为可能影响结果的重要变量 也是实验者应该控制和在设计中考虑分模块的可能因素 3 引入统计学分析的辅助变量1 协变量分析指那些可以测量但不容易控制又影响反应的变量 在统计学分析时可以采用变形的方式减少它对实验结果的影响 例如 实验中观察某个指标的增加情况 可以在统计学分析中以增加的百分率形式进行比较 可以减少初始值差异对结果的影响 2 多次测量在许多实验中动物都是天天观察和测量 这种多次测量 实际上可以将测量的错误 平均掉 从而增加分析的精确度 许多情况下 简单地将多次测量的数据总和起来就可以了 例如 整个实验期间动物体重的增加可将每天动物体重增加的数据总和 另一些情况 表现为反应线的斜率 反应峰值时间 或曲线下的面积 总之采用多次测量 得到数据的一个完整集合形成实验结果的一部分 并可能通过适当的分析提供相关的信息 3 多变量分析在有些动物实验中 每只动物测量好几个不同的特征 例如 10个以上的血液特征参数被同时测定 在涉及基因微阵列的实验中 在一个个体中几千个特征要被测定 那么这时多变量分析的方法就值得去采用 4 利用辅助变量探测局外数据局外数据或极端数据 对分析有不利的影响 扰乱统计分析的结果 导致产生错误的结论 但不幸的是 对于这些数据的探测和判定和处理还没有一个明确的解决办法 有些局外数据是转抄或输入的错误 可以通过追查记录更正 而有些情况下 辅助变量可