快速检测诊断仪器研发重庆医科大学医学专业技术试验教学中心.doc

团队科技创新计划重庆医科大学检验医学院“泛鹰”科技创新团队目录一、基础实验（1）课题方向人员配备典 例二、快速检测诊断仪器研发（2）课题由来人员配备课题进程 第一阶段 研发方向分析 （3） （一）现今检测仪器分析 （二）确定研究方向 第二阶段 研发方法调研 （3） （一）整体方向 （二）工作内容 第三阶段 研发标志物确立 （4） （一）FABP研究考察 （二）L-FABP检测调研 第四阶段 研发设计方案 （5） （一）设计理念 （二）样机设计 （三）预实验 （四）实验扩充 第五阶段 研发分期计划（7） （一）当前目标 （二）近期计划 （三）长期规划三、产品推广（12）目标规划产品产出市场调研四、前景展望（13） “泛鹰”科技创新团队（以下简称“泛鹰”团队）将在接下来的时间里，继续坚持常规活动，培养更多集信息技术知识、英语技能及科研基础于一身的人才，在丰富大学生活的同时，吸引更多志同道合的同学加入“泛鹰”科研平台。“泛鹰”团队在重庆医科大学检验医学院肾脏病学分子实验室的大力支持下，现已有十多名大学本科同学着手自己的创新实验。以分子肾脏病学为基础，形成了基础实验、仪器研发、产品推广三个研究项目。一、基础实验课题方向 1. Hippo YAP Signal Pathway； 2. WT1和Tgf-beta相互作用关系及作用方式的研究+调控mxi1的miroRNA在这个基因对系膜细胞凋亡和增值中的调控作用； 3. microRNA16-1与Sall1的关系；micro181调控mfoxj1的作用； 4. foxk2在BMP7信号通路里的作用的研究； 5. microRNA通过tak1影响mm细胞的增殖和凋亡； 6. microRNA对小鼠Bmp7/TCf21增殖凋亡的调控； 7. 小鼠肾脏中的BMP信号通路表达谱分析； 8. ert2介导的Talen时间可调控基因敲除等； 9. 这些同学的课题已在博士研究生的指导下顺利地开展并初具实验成果，并且很有希望发表自己的SCI论文，在科研的道路上走出自己的第一个脚印。人员配备 由于“泛鹰”团队分层次的培养计划，使得各梯度之间有很好的衔接和带动作用。在师兄师姐的带动之下，也有越来越多的同学进入实验室学习，并能较快掌握基本实验操作，熟悉分子克隆等知识，独立完成系列实验。同学们利用寒暑假等课余时间，在实验室相互学习，并不断充实自己，相信“泛鹰”团队的成员都能陆续做出自己的成绩，同时为国家的科研团队贡献自己的一份力量。典例现就其中一个课题“ert2介导的Talen时间可调控基因敲除”做一个详细的介绍：通过在分子细胞试验和动物实验，探索它莫西酚可调控的ERT2与Talen融合表达之后，是否能够实现药物可诱导的Talen基因敲除，从而实现一种、高效的，时间可调控的基因敲除方式。为了探讨ERT2与Talen结合起来实现时间可调控性基因敲除的设想，我们首先需要在体外通过分子生物学手段构建ERT2与Talen的融合表达工具载体。同时为了方便检测Talen的基因敲除效率，我们需要构建一个灵敏的，可视化的报告系统，为此我们选择已普遍应用的LacZ和DsRed报告基因，分别设计特异靶向LacZ和DsRed的Talen载体，并将该Talen蛋白编码框与ERT2融合表达出ert2-Talen融合蛋白，在药物诱导条件下，通过直接观察LacZ染色或LacZ酶活性和DsRed荧光蛋白来定性和定量地评价ert2-Talen的切除效率。根据所依托研究机构的现有资源，我们拟进行以下试验：为了验证eGFP-ERT2-Talen融合蛋白是否保留了ert2药物诱导入核功能，我们可以在药物（它莫西酚）诱导的条件下，直接观察eGFP的亚细胞分布，以判断融合蛋白是否入核，其核转移是否具有药物依赖性。选取HEK293T细胞，把pCMV-eGFPERT2Talen(LacZ)和pCMV-eGFPERT2 (DsRed) 载体转染进入细胞，通过观察eGFP绿色荧光蛋白在胞体内的分布记录Talen-ERT2的位置，然后在细胞培养基中加入Tamoxifen，使Talen-ERT2融合蛋白在Tamoxifen作用下进入细胞核，再次通过观察eGFP绿色荧光蛋白在胞体内的分布记录Talen-ERT2的位置，查明是否入核。药物依赖的eGFP-ERT2-Talen基因切除效率的验证为了验证eGFP-ERT2-Talen对靶基因的切除是否可以被它莫西酚诱导，同时评价对靶基因的切除效率，我们分别将pCMV-eGFPERT2Talen(LacZ)和pCMV-eGFPERT2(DsRed)分别转染到组成型表达LacZ和DsRed的细胞中，在加入或者不加入它莫西酚药物的情况下，对细胞进行LacZ染色和Dsred红色荧光蛋白的观察，判断eGFP-ERT2-TALEN融合蛋白是否在Tamoxifen作用下进入细胞核，发挥基因敲除的作用，通过细胞计数评价基因敲除效率。实验证明，ert2-Talen的融合蛋白可以在Tamoxifen的作用下进入细胞核并进行基因敲除二、快速检测诊断仪器研发课题由来该研究课题由小组长刘佳宁率先提出，得到“泛鹰”团队发起人重庆医科大学检验医学院常务副院长周钦的大力支持。最初的想法源于雅安地震中，有一位被困人员因为长时间被隔绝在废墟之下，造成血钾过低，最后因病因查明不及时而面临生命危险。因此，快速检测的仪器设备研发与现实社会市场需要是相符合的，具有可行性、合理性和前瞻性，对检验事业的发展也很有推动作用。人员配备仪器研发研究小组由本科二年级刘佳宁担任小组长，集结“泛鹰”团队中一批充满科研热情，对仪器研发有想法和坚持的同学。研发成员的主要年级组成是检验本科二年级、一年级同学，其中组长主要负责具体研究方向的确立、调整及任务的分工，二年级同学主要负责仪器各项目的研究把关，一年级同学负责资料查找等辅助工作。课题进程第一阶段 研发方向分析(一)现今检测仪器分析 1. 现今检测仪器具有特点:自动化、高效化、小型化和大型化。 2. 现今检测方法:胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）、酶联免疫法及胶体金法。 3. PETIA检测法分析： PETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。国外已有多家公司提供纳米级表面修饰的微球粒子原料，并广泛应用于PETIA。这些厂家提供的粒子直径从20nm4m，检测的灵敏度得到了极大的改善，检测灵敏度最高可达到1.0ng/ml。可以作为多克隆抗体和单克隆抗体的载体。纳米级粒子的推出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。(二)确立研究方向 通过周钦院长的联系，研发小组与学院从事传感器研究的丁世家教授和从事电化学研究的谢国明教授商议，决定从肾脏病的快速检测着手，研发仪器主要包括探测器、处理器及显示器，更近一步地，可以使显示器信息具备电脑传输能力，可以完成远程传送。第二阶段 研发方法调研（一)整体方向（按照优先等级排序） 1. 搜集目前肾脏方面比较有价值的指标 2. 微流控的整体调研 3. 电化学调研 4. 免疫金调研 5. 招募更多的同事（二）工作内容 1. 人员分配 （1）微流控的调研：刘佳宁 （2）肾脏有价值标记物：辜玉萍、欧欣颖、万雪颖、倪东升 （3）免疫金调研：曾惜、刘佳、蒙秋蓉 （4）电化学调研：雷绍鹏、向平松 （5）最新技术调研：何琦、王杨燕 2. 微流控总体调研 3. 肾脏病标志物 （1）针对已有的检测手段进行调研，并选择性升级 （2) 通过选择一种或几种肾脏疾病，对其研究以后选择标志物进行研究 （3) 借助互联网网站，在基因水平上进行研究并推测此基因会引发的肾脏疾病，并由此推测出所需检测蛋白第三阶段 研发标志物确立（1） 脂肪酸结合蛋白（FABP）研究考察 1. 人类肝脏脂肪酸结合蛋白（ HL- FABP ）已作为一个细胞内的脂质分子穿梭，在全身代谢平衡中发挥了核心作用。 HL- FABP的参与，在运输胆盐已经假定，但几乎没有研究。 2. 肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）在体外结合贝特类药物和PPAR的提高贝特类药物诱导的PPAR在转化细胞中，这些研究结果的功能意义不明确的，特别是在正常的肝细胞。与原代培养的小鼠肝细胞的研究表明： （1）在生理葡萄糖（6毫米），贝特类药物（苯扎贝特，非诺贝特）只有微弱的基因转录激活PPAR长链脂肪酸的-氧化。 （2）高血糖（ 11-20毫米），但麦芽糖（渗透压控制）显着增强，这些和其他PPAR靶基因mRNA的表达增加了长链脂肪酸的-氧化的贝特类药物诱。 （3）苯扎贝特行动所需的高血糖程增强需要一个完整的L-FABP/PPAR所示与L- FABP空，空PPAR ， PPAR抑制剂治疗的WT ，或PPAR特定的非诺贝特治疗的WT肝细胞的信号转导通路。因此，高血糖发生程增强PPAR通过FABP / PPAR而非间接通过其他PPARs的或葡萄糖诱导的信号通路。（二）肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的检测调研 1. L-FABP人肝脏型脂肪酸结合蛋白为一种小分子蛋白质，分子量为13KD左右。目前是新型的肾脏疾病早期诊断指标以及肝脏早期病变的检测指标。现在已有针对L-FABP的ELISA的商品化试剂盒，其检测范围为1.56-100ng/nl，；灵敏度为0.64ng/nl。 2. L-FABP在人体中的生理作用主要是转运长链脂肪酸，因其上有一可结合长链脂肪酸的特异位点，但是对于其转运的脂肪酸种类是否为特定某一脂肪酸类型尚不知晓。 3. 研发想法：若是能够确定L-FABP结合的长链脂肪酸的种类，是否可以通过L-FABP与该脂肪酸的结合间接测定其的含量，检测的方法可以是荧光标记，化学发光类的试剂或是试纸条，也可以是非标记类的如电化学方法，以及胶体金法将其制成快速检测试纸条。但这种方法的特异性及敏感性，标本中其他物质对其的干扰因素有多大，尚不清楚。但可以在确定的胶体金检测方法中，检测时间长是其致命缺点。经过查阅2013年所发表的电化学及生物传感器方面的检测方法（文献来自Biosensors and Bioeletronics），可以借鉴用于L-FABP检测的方法： （1）与ELISA结合的电化学免疫分析法（Electrochemical impedimetric immunosensor for the Detection of measles-specific Ig-G antibodies after measles infections） 此文献叙述的主要是将ELISA与电化学分析方法结合，运用于对于麻疹抗体的检测，该方法检测麻疹抗体响应时间短，线性范围宽，不用特异性标记，最低检测限亦较低，因而较为实用。研发想法：是否可以将麻疹抗体换为L-FABP抗体，用其与L-FABP的特异性结合检测L-FABP。 （2）基于蛋白质与碳水化合物相互结合作用的电化学免疫分析法（Glycosylated aniline polymer sensor ：Amine to imine conversion on protein-carbohydrate binding）。 此文献叙述的主要是运用电化学发对刀豆A蛋白的检测方法。此方法是将刀豆蛋白结合到某个碳水化合物，通过检测电极电位的变化来反映溶液中的刀豆A蛋白的浓度。我认为可以借鉴的地方在于：有关文献曾报道L-FABP表面有可以和脂肪酸链结合的位点，那么是否可以通过寻找到某个能和L-FABP结合的连接有长链脂肪酸的碳水化合物，再套用文献中检测刀豆蛋白的方法，检测L-FABP。第四阶段 研发设计方案（一）设计理念【目标】 快速、高效、准确、便携【设计综述】 随着当今社会的发展，对于快速便携的检测产品的需求是显而易见的。并且，在科技不断进步的今天，新的标志物层出不穷。如何将最新最有效的标志物更快的应用于临床，将会是十分有前景的研究方向，也是本系列产品的方向。我们的产品将会是以模块化、系统化呈现。系统主要由四模块组成：探头（接触标本）模块、处理模块、显示模块以及传输模块。而系统的最精华部分位于探头模块，具体可参考移液器我们可以根据不同的检测需要更换不同的探头，类似于移液器的枪头更换一样简便。在更换探头和，通过调节旋钮来更换程序。由于我们使用电化学免疫传感器，对于标本不需要进行稀释等前操作，而其本身检测时间也短，所以，本产品的使用环境更加广泛（2） 样机设计 1. 样机目标标志物：L-FABP 2. 样机检测方法:电化学免疫传感器测阻抗 3. 样机预使用电极:丝网印刷石墨电极 4. 待预实验解决问题: （1）信号放大器的选择：三极管、变压器等 （2）检测电阻部位 1）将电极视为电阻，在结合前后检测电极电流变化。 2）将标本尿液作电阻，通过检测结合前后尿液电流变化计算标志物的量。 （3）关于抗体-抗原结合的细节优化：是否需要添加其他物质，使得结合物结合时间更加短，结合物更加稳定 （4）处理器的程序设计 （5）反应中电极电阻变化范围【参考文献】 Analysis of DDT Isomers with Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Optical Immunosensor Based on Rat Monoclonal Antibodies as Biological Recognition Elements. 1. Effects of immobilization on a FRET immunosensor for the detection of myocardial infarction 2. Monitoring of urinary L-type fatty acid-bingding protein predicts histological severity of acute kidney injury 3. Enzyme immunosesor for diagnosis of myocardial infarction（三）预实验预实验一【实验目标】 验证在以尿液或类尿液的环境中，通过改变电阻大小导致的电流变化，用哪种放大器效果好【实验器材】 三极管，变压器，电解液槽*2，健康人尿液（尿液类似液），电流表*4，电源*2，大小电阻（5种*2组），保护电阻*2，导线若干【实验原理】 通过检测对比电流在经过信号放大装置前后的变化来确定两个装置的信号放大能力。【实验步骤】 1. 组装好三极管和变压器装置 2. 向两个相同电解槽中加入等量尿液或尿液类似液 3. 连接好包括电源、信号放大装置、电阻、电流表等的回路 4. 将电阻浸入液体中 5. 记录四个电流表的读数 6. 更换电阻后重复步奏5 7. 清洗回收实验器具【实验注意事项】 1. 不同电阻间电阻值差距要适中，MIN与MAX参考预实验5 2. 实验电源电压控制在3V，以模拟产品使用干电池情况 3. 在最后评估两个装置时，不仅考虑电流放大的倍数，还要讨论成本、体积、耐用度、稳定程度 预实验二【实验目标】 通过实验需要确定最终产品检测电阻的部位是溶液还是电极【实验器材】 铂金电极*2，L-FABP抗体，L-FABP溶液，丝网印刷石墨电极*2,电流表，电解液槽*2，电源，健康人尿液（尿液类似液），保护电阻*2，导线【实验原理】 当以溶液为电阻时，将铂电极接入回路，石墨电极只接一头。当以石墨电极为电阻时，铂电极只放在溶液中，不接入回路，同时将石墨电极两头接入回路。通过观察电流变化评估两种方法的优缺点【实验步骤】 1. 将等量L-FABP抗体分别附于两个石墨电极上 2. 连接好实验回路，将铂电极与石墨电极放入电解槽，注入等量液体 3. A组为溶液电阻组，B组为电极电阻组。将A组铂电极接入回路，B组铂电极不做处理，将石墨电极两段接入回路 4. 等待读数稳定后，记录电流表数值。并加入等量L-FABP溶液，等待20min 5. 记录第二次读数 6. 实验完毕，清洗回收实验器具【实验注意事项】 1. 实验需要重复多次，方可进行评估 2. 在进行步奏4时，待读数稳定以后再进行步奏5 3. 评估时，除考虑电流表读数以外，还要考虑接合的时间长短以及成本问题四、实验扩充 本实验中可扩充一组：将A组的铂电极换为另外一组丝网印刷石墨电极，同时附着等量的L-FABP抗体。以提高对标志物的结合速度第五阶段 研发分期计划（一）当前目标 在2013年寒假着手实验，将L-FABP样机成型，并尽快投入检测。（见图1）附：显示器处理器信号放大器以下部分可以替换电极横截面探头图1.程序模块化草图（二）近期计划 通过查阅文献、进行探究实验等方式进行仪器的完善，如寻找比单抗更加经济的标志物结合方式，将显示器与信息远程传输相结合等。（三）长期规划 在完成基本仪器的研发之后，根据实际情况着手微流控、免疫金的研究微流控调研详述。 微流控作为21世纪一项重要的科研产物，随着现代对科技发展的要求越来越微型化、集成化，微流控技术的前景着实让人期待。早在1995年便成立了首家微流控公司，1999年推出首款商品化仪器。虽然我国对此技术研究较晚，但我国科学家对此技术已做出卓越成绩2006年，我国科学家关于微流控的SCI文章数目跃居全球第二。【定义】 微流控是一门集合生物、化学和医学分析过程中样品的制备、反应、分离和最终检测等基本项目为一块微米级芯片上的多学科相交叉的技术。微流控将多种单元技术在整体可控制的微米级平台上组合、集成。正因为此，它与传统手段相比拥有高灵敏度，高分辨率，高效率以及低消耗，低成本。并且，其集成化的模式大大缩小了设备的体积。从长远角度看，微流控技术最终能达到设备的小型，快速，精准，低碳还有家庭化。而且由于流体处于微米级别，正赋予了流体很多宏观条件不具备的特性。【方向】微流控种类多样化，在与我院科研方向及优势项目相比较后，重点考查微流控在检测DNA及蛋白质中的应用【基因检测】微流控对于基因突变的检测以乳腺癌为例，BRCA1和BRCA2是乳腺癌的易感基因，微流控技术已用于检测BRCA1与BRCA2。检测示意图见图2。用微流控对BRACA1与BRCA2的检测速度比毛细管电泳快1/10，并且可以同时筛查多个突变。【蛋白质研究】在蛋白质研究