第四讲酶催化、生物催化与微生物

1 第四讲酶催化 生物催化与微生物转化 2 酶是生物催化剂 生物催化剂不仅包括从生物体 微生物 动物 植物 中提取的各种游离酶 还包括可以直接作为酶源使用的各种生物细胞 固定化的酶和固定化细胞 3 因此生物催化剂可以是微生物 动物 植物的整体细胞 也可以是从细胞中提出来的酶 它们可以游离的形式使用 也可以采用固定化技术将其固定在多孔介质表面后再使用 4 利用酶或有机体 细胞 细胞器 作为催化剂实现化学转化的过程 称为生物催化 生物催化中常用的有机体主要是微生物 其本质是利用微生物细胞内的酶催化有机化合物的生物转化 又称微生物生物转化 5 微生物生物转化在有机合成中有着重要的用途 它能提供廉价和多样的生物催化剂 酶 或以完整细胞直接进行生物催化 6 在生化反应过程中 若采用活细胞 包括微生物 动物 植物细胞 为催化剂时称发酵或细胞培养过程 若采用游离酶或固定化酶时称为酶催化过程 7 它们的区别在于发酵过程中除得到反应产物外 还可能得到更多的生物细胞 而酶反应过程中 酶则不会增长 上述两类反应过程 从催化作用的实质看是没有什么区别的 利用活生物细胞作为催化剂的发酵生化反应 其实质也是通过生物细胞内部的酶起催化作用 8 第一节微生物转化反应的特点 微生物转化反应 可以采用发酵方式进行转化 也可以按静止的洗涤细胞或固定化细胞等方式进行连续生产 它与有机化学合成和酶法合成相比较有下列特点 9 1对立体结构合成具有高度的专一选择性 微生物转化反应是一种酶的催化反应 对底物 即反应物 作用时 具有高度的立体结构选择性 它不仅对结构有化学选择性和非对映异构体选挥性 并且有严格的区域选择性 面选择性和对映异构体选择性 10 1 化学选择性 同一微生物在不同的培养基中培养 其转化底物产生不同的化学选择性 2 甲基丁腈 光气 3 氰基吡啶 11 例如红球菌生长在含有COCl2培养基中 所产生的酶将底物 10 1 水解为酰胺 10 2 而生长在含有2 甲基丁腈培养基中 所产生的酶将底物 10 1 水解为羧酸 10 3 12 2 非对映异构体选挥性 非对映异构体选择性是指对非对映异构体的氢或基团进行催化反应 导入一个非对映体的基团 这类选择性生物催化的例子 大多是对亚甲基中2个非对映体氢的进行催化 导入一个基团 13 黄体酮 14 例如来自黑根霉生物体的酶选择性氧化羟基黄体酮 10 4 的11 位氢 生成11 羟基黄体酮 10 5 而来自新月弯孢霉生物体的酶则选择性地氧化甾体化合物的 10 6 的11 位非对映异构体氢 形成11 羟基化合物 10 7 15 3 区域选择性 16 应用粪产碱杆菌对乙基环己烷选择性氧化时仅作用于4 位上的次甲基 生成反式乙基环己烷醇 侧链不起氧化反应 而诺卡氏菌对丁基环己烷选择性氧化时 仅作用于环己烷的侧链丁基 生成环己烷丁酸 显示了酶的区域选择性氧化反应 17 4 面选择性 无环 酮酯易被酵母还原为 羟酯 羟酯 这种产物 是 内酰胺 昆虫激素和类胡萝卜素等合成的手性源 18 R1小COOR2大 R1大COOR2小 H H 酮酯 酮酯 19 氢负离子按Prelog规则从空间位阻小的一面向羰基亲核进攻 形成稳定的优势中间体 还原醇的手性中心构型由底物结构决定 即与羰基两侧取代基的大小有关 20 5 对映异构体选择性 环氧马来酸 S S 酒石酸 R R 酒石酸 21 如一种粪产碱杆菌 Alcaligeneslevotartaricus 微生物催化环氧马来酸 10 8 的水解反应 其产物为 S S 酒石酸 10 9 而以枯草杆菌微生物催化 10 8 的水解产物则为 R R 酒石酸 10 10 22 这种严格的立体结构选择性 对有机合成特别是药物合成来说是非常重要的 因为药物的异构体不仅无效或低效 并且往往还有副作用 甚至有相反的药效和强力的毒性 23 特别像生理活性很高的激素 抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效对立体结构的要求很高 往往具有严格对映体构型的要求 此为有机化学合成方法难以达到的 24 2微生物转化反应条件温和 设备简单 公害少并且反应速率快 微生物转化反应一般都在常温和pH为7左右进行催化合成 无需高压 强热等苛刻的条件 所以设备简单 反应条件温和 生产安全 原料除底物和普通培养基外没有其他化学品 因此一般无公害 25 微生物转化反应是酶催化反应 在最适条件下 酶能在一秒钟内使102 106个底物分子转变成产物 26 3微生物转化收率高 成本低 微生物转化反应是在全细胞内进行 保持原有整体酶系统比较符合生物催化所需环境与条件 在氧化 还原等催化反应时不需添加辅酶 辅酶非常不稳定 难以分离制取 这是酶法合成中很难补救的 27 微生物转化反应可以持续进行 反应量大 收率高 可以大规模工业生产 加上设备和原料简单易得等优点 生产成本不仅低于酶法合成 并且也低于化学合成 28 4微生物转化可以减少反应步骤 通过酶合成基因构建得到的基因工程菌 可以将原需几步催化中间体过程在一次发酵中转化完成 将几步中间体合成中转化酶的合成基因 通过基因构建于同一个工程菌中 在发酵法转化时需几步催化合成的中间体就能一步转化成功 29 例如维生素C生物合成中基因重组葡萄糖酸氧化杆菌的代谢工程菌 将L 山梨糖脱氢酶基因和L 山梨酮脱氢酶基因 通过基因重组构建成一个代谢工程菌 发酵可以在同一次转化发酵中将D 山梨醇转化成 酮 L 古洛糖酸 30 第二节生物转化实验方法 1生物催化剂的来源与制备方法2微生物转化实验过程3微生物转化方法4微生物转化的影响因素5产物的检测与分离纯化6对映体过量 31 1生物催化剂的来源与制备方法 离体酶主要来源于动物 植物 微生物等的含酶细胞 组织或器官 通过提取法可制得多种离体酶 32 例如 从动物胃中提取分离胃蛋白酶 从动物胰脏中提取胰蛋白酶 胰淀粉酶 胰脂肪酶 或这些酶的混合制剂胰酶 从动物血液中提取超氧化物歧化酶 SOD 从木瓜中提取木瓜蛋白酶 从波萝中提取波萝蛋白酶 从大肠杆菌中提取谷氨酰胺酶等 33 完整细胞主要来自于微生物 通过微生物发酵法来制备各种含酶细胞 例如以酿酒酵母为菌种进行发酵 可得到含有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶等多种酶和辅酶的酵母细胞 34 有机合成中所用的酶一般为粗品 其酶含量仅有1 30 其余是无活性的蛋白质 稳定剂 盐或者含有提取过程中混杂进来的多糖 酶的粗品比纯品更为稳定 但粗酶催化反应的副产物多 随着蛋白质分离纯化技术的发展 生物催化反应中纯酶的使用正在逐步增加 35 2微生物转化实验过程 微生物转化实验的简要过程如下 选择菌种 成熟菌丝或孢子的培养 选择适当的转化方式 转化培养 即生物转化 或转化菌丝及孢子悬浮液转化 转化液的分离提取 产品精制 36 1 选择菌种 选好菌种是进行转化反应的关键步骤 可以根据转化反应类型 选择能产生催化这类反应酶的微生物 一般可向国家 地方保管菌种委员会或学校 研究机关去函索取 购买 37 2 配制培养基 一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满和富含需要的酶 按转化菌种的培养特征和转化反应需要配制培养基 为成熟菌丝或孢子的培养做准备 38 3 投转化底物 选择适当的菌株生长期加底物 并考虑选择加底物的方法 例如固体加料或液体加料 和方式 例如连续或间歇加料 39 4 添加刺激剂或抑制剂 添加刺激剂的目的是提高酶活力和增加酶生长量 添加抑制剂的目的是抑制酶副反应或抑制其他对反应不良酶的生长 40 5 转化过程中各项影响因素的控制 例如开始加底物时间 加入的底物和转化的产物在转化环境中最大稳定的滞留时间 适宜的转化温度 pH值和菌丝浓度等 41 6 转化反应终点的控制 根据影响转化反应的各种因素 控制好转化反应培养终点 使底物转化达最大反应完全值 当取样分析反映转化培养液中转化产物积累量不再增加时 立刻采用物理方法将菌丝体 包括转化反应的胞外酶 及培养物除去来停止转化反应 42 7 分离精制转化产物 转化产物已与生物转化系统分开 可按化学方法将产物分离精制 一般来说转化过滤液中杂质含量大 产物浓度低 43 微生物转化实验过程 选择菌种成熟菌丝或孢子的培养选择适当的转化方式 转化培养 即生物转化 或转化菌丝及孢子悬浮液转化转化液的分离提取产品精制 44 3微生物转化方法 生长细胞培养转化法静止细胞培养转化法固定化细胞转化法 45 生长细胞培养转化法 生长细胞培养转化法 是在微生物细胞培养前或培养一段时间后 直接将底物投入到微生物生长培养基中 利用微生物自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化 这种转化一般在摇瓶或发酵罐中进行培养转化 46 摇瓶转化实验主要用于筛选菌种和发酵罐放大转化反应条件的选择 在通气的条件下将微生物培养至生长旺盛的对数生长期的中期 或在后期所产生酶的晚期时加入底物进行转化 极个别也有在生长早期加底物 此根据转化需要的酶生长情况 47 加入的底物可以粉末状的固体或底物的水溶液 必要时也可以应用有机溶剂 投料方式可以一次或分批 48 生长细胞培养转化法是最简单和最常用的一种方法 优点是微生物生物转化容易 效率高 缺点是产物的后处理及分离纯化烦琐 一般适用于经过诱变处理的微生物菌株 它可以底物作为唯一碳源 也能适应连续化生产过程 49 静止细胞培养转化法 静止细胞培养转化法 是把微生物细胞在一定的条件下培养一段时间后 经离心收集菌体 将菌体悬浮于水或缓冲溶液中 然后加入底物 在适宜的温度 pH和振荡条件下进行转化的方法 50 静止细胞转化法是将一种生长影响减至最小情况下进行生物转化 它通过提高菌丝体浓度可以达到加快转化速率的目的 51 应用干细胞进行转化是另一种静止细胞转化法 便于贮备随时使用 干细胞制备有两种方法 冷冻干燥法和丙酮干粉制备法 静止细胞培养转化法的优点是产物后处理简单 没有培养基成分的污染 缺点是增加了额外的菌体收集与重悬过程 52 固定化细胞转化法 固定化细胞转化法是指利用化学或物理手段将游离的细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性及可以反复使用的特性 然后用于催化有机化合物的生物转化得到所需产物的方法 53 制取固定化细胞的方法分为两大类 将细胞与固定材料通过化学反应相结合或分子键的缔合 称共价键合 将整个细胞包埋在胶质材料 如角叉菜胶 卡拉胶和海藻胶等 内 称包埋法 54 目前获得广泛应用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合的固定化方法和角叉菜胶的包埋法 其固定化细胞也可悬浮于培养基中发酵生长同时进行生物转化 以保证辅酶的再生以及新活细胞的生长 55 固定化细胞转化最大优点可以长期反复使用 有的能维持有效催化达数月之久 还有分离纯化容易 因此便于自动化和大规模工业生产 缺点是固定化细胞的生物转化活性比游离细胞的生物活性低 56 4微生物转化的影响因素 微生物生物转化最重要的步骤是底物与催化反应的酶之间的相互接触 而参与生物转化反应的微生物酶一般是微生物胞内酶 底物必须能透过细胞壁和细胞膜 57 因此底物添加方法对转化率有很大影响 必须考虑底物的各种性质如渗透性 溶解性 稳定性及毒性等 58 如果添加能溶于水的底物到培养基中进行转化是比较容易的 主要注意的问题是加底物量的多少 添加的速度和底物对转化的微生物是否有毒性 应用含酶活力强和含酶量多的微生物进行转化时 添加底物的速度可以快 添加底物的量也可以多 59 对一般微生物转化来说 非离子化合物的底物最大投料质量浓度约为10 对离子化合物的底物最大的投料质量浓度约5 60 此外 不同的微生物对有毒的底物的忍受力是不一样的 添加底物速度与添加量要低于微生物的忍受量 一般在微生物生长期耐受有毒底物的能力比较低 61 必须注意的是即使非毒性的底物 当转化到积累至大量时 也能产生对转化微生物的抑制作用 最好随时分离转化产物 例如采用两相 水 有机溶剂 转化法或固定化细胞转化法 62 如果添加不能溶于水的底物是比添加水溶性的底物要困难得多 可以采用多种方法加以克服 63 1 用细粉末状的固体投料 这样可使转化细胞和粉末底物之间有最佳的接触面积 若要转化气体状态的碳氢化合物 如甲烷 以气泡形式从底部通气 使泡慢慢通过转化培养基来增加相互接触面积 获得良好的转化效果 64 2 利用非毒性表面活性剂利用非毒性表面活性剂如吐温80类也能分散不溶性底物 增加转化细胞和底物相间接触 65 3 利用无毒性溶剂如95 乙醇 丙酮 N N 二甲基甲酰胺和二甲亚砜等来溶解底物 这是较理想的办法 但是这类有机溶剂在水中的溶解度很大 且底物浓度很高 因此每次添加的量应尽量的少 最好在添加底物前测定该有机溶剂的忍耐度 66 另外 在培养菌丝体和转化过程中的适当阶段 有时另加诱导物 促进剂或抑制剂来促进酶的生成 提高酶的转化活力或抑制副反应产生 67 5产物的检测与分离纯化 在生物转化过程中底物的减少或产物的增加可采用薄层色谱法 TLC 高效液相色谱法 HPLC 或气相色谱法 GC 等分析技术进行鉴定 68 根据分析结果可以随时判断生物转化进行的程度 确定底物的最高转化率和产物的收率等 得出生物转化反应的最佳条件 69 产物的分离纯化一般先将微生物细胞与转化液相分离 常采用抽滤或离心法 固定化细胞转化法则可省去此步骤 然后用有机溶剂从滤液中萃取转化产物 若为非中性产物则应调节溶液pH值 以提高萃取效率 70 虽然生物转化产物绝大多数存在于转化液中 但在菌丝体中也会残留一些 因此很有必要用有机溶剂对菌丝体萃取1 2次 以提高转化产物的收率 71 真菌类转化产物的分离一般先采用离心或抽滤法将菌丝体与转化液相互分离 但细菌类转化产物的分离一般则不需要采用分离步骤 可直接用有机溶剂萃取产物 直接用有机溶剂萃取可能会导致产物中含有少量细胞组分 72 萃取所得粗品需进一步的分离纯化才能得到纯品 常用的精制方法有重结晶 柱层析法和色谱法等 73 6对映体过量 有机合成中常用化学产率 yield 来描述有机合成反应的实验结果 产率是指实际产量与理论产量的百分比 而对于手性合成则既要考