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入侵植物春飞蓬的生物检定与化学成分讨论论文 春飞蓬(ErigeronphiladelphicusL.)为菊科(Compositae)飞蓬属(Erigeron)植物又名费城飞蓬与一年蓬(Erigeronannuus(L.)Pers.)的植物形态极其相似该植物于20XX年出现在我国浙江、福建、上海、江苏和安徽等省市是一种源自北美的外来入侵植物20XX年山东境内也发现有春飞蓬我们对其进行了初步研究 1实验材料、仪器与试药 1.1实验材料 所用实验样品于20XX年5月采自山东济南经山东中医药大学生药教研室徐凌川教授鉴定为菊科飞蓬属植物春飞蓬(E.philadelphicus)L.地上部分;花粉粒的对照样品采自一年蓬(E.annuus(L.)Pers.)的花序一并通过鉴定;春飞蓬的干燥地上部分粉粹后过40目筛备用 1.2仪器 SUPRATM55热场扫描电子显微镜(德国蔡司公司);DK8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司);DYY8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司);YXJ2离心机(湘仪离心机仪器有限公司);PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司);H61微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂);凝胶成像系统(GeneGenius公司);U3010紫外可见分光光度计(日立公司);Blospin植物基因组DNA提取试剂盒;移液器范围(1001000mL20200mL0.510mL)(赛默飞世尔科技公司);UV5800(上海元析有限公司);Waterse2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)等 1.3试药 芦丁对照品(批号:YM0313SA14);灯盏花乙素(野黄芩苷)对照品(批号:ZM0520XA14)亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇所用试剂均为分析纯 2实验方法与结果 2.1基原鉴别春飞蓬为一年生或越年生草本植物茎直立高30100cm粗壮上部有分枝植物密被开展长硬毛及短硬毛(毛较多明显)叶互生基生叶莲座状卵形或卵状倒披针形两面被倒伏的硬毛叶缘具粗齿花期不枯萎茎生叶基部半抱茎;中上部叶披针形或条状线形顶端尖基部渐狭无柄边缘有疏齿被硬毛头状花序数枚直径68mm总苞片3层草质披针形长35mm淡绿色边缘半透明中脉褐色背面被毛;舌状花2层雌性舌片线形长约6mm平展蕾期下垂花期仍斜举舌状花白色略带粉红色管状花两性黄色花期为35月皮细胞及气孔2花粉粒3导管4纤维5冠毛6花药碎片7非腺毛8茎部薄壁细胞(细胞壁念珠状增厚)图1春飞蓬粉末图Fig.1PowderfigureofE.philadelphicusL. 2.2显微鉴别 2.2.1粉末的显微观察黄绿色水合氯醛加热透化装片可见具三孔沟、近圆形的花粉粒表面为齿状凸起直径约为1820m非腺毛基部为23个细胞并列顶端细胞尾尖形如刺刀气孔椭圆形为不定式纤维多成束存在壁厚导管多为螺纹导管茎部薄壁细胞其壁呈念珠状增厚 2.2.2花粉粒的观察取春飞蓬与一年蓬的花粉于标本托上喷金后分别观察两者的花粉粒扫描电镜图显示春飞蓬花粉粒的齿状纹饰稀疏顶端刺渐尖直径约为18m(图2a);而一年蓬的齿状凸起相对较多且花粉粒直径大约为22m齿状凸起基部膨大顶端刺骤尖 2.3分子鉴别 2.3.1方法通过Blospin植物基因组DNA提取试剂盒来分别提取两种植物的总DNA利用一对通用引物ITS1ITS4进行PCR扩增(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)通用引物由上海生工生物工程有限公司合成PCR扩增反应体系:2Taqmastermix25L、DNA模板4L、ITS1引物2L、ITS4引物2L、ddH2O17L将反应体系中的所有成分精密移取至PCR管中并充分混匀后放入PCR仪中扩增程序:94预变性3min再进行35个循环(94变性30s50退火30s72延伸1min)最后72延伸10min产物于4冰箱保存PCR产物检测:PCR产物5L用3LEB染色在浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测用凝胶成像仪照相PCR产物测序:将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序 2.3.2实验结果将本实验所得的ITS序列输入到NCBI上的GenBank上Blast后进行同源率分析结果显示1号与春飞蓬同源率为99%我们可以认定为该植物即为春飞蓬;2号与一年蓬同源率为99%可以判定该植物为一年蓬故可从分子方面对两者进行区分 2.4总黄酮含量测定 2.4.1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0mg置100mL量瓶加70%乙醇定容至刻度即得对照品溶液 2.4.2供试品溶液的制备取春飞蓬粗粉约2.5g精密称定后加入14倍量70%乙醇加热回流提取3次(1h1h1h)3次回流后合并滤液使其在水浴上蒸干溶剂最后用70%乙醇定容至500mL量瓶中即得 2.4.3标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5mL分别置于10mL量瓶分别加入70%乙醇2mL精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀放置6min精密加入10%硝酸铝溶液0.3mL混匀放置6min精密加入氢氧化钠试液2mL摇匀放置10min用70%乙醇稀释至刻度以相应试剂为空白采用紫外可见分光光度法在510nm波长处测定吸光度以芦丁对照品浓度为纵坐标(Y)溶液吸光度值为横坐标(X)作标准曲线回归方程为Y=0.0684X+0.0028R=0.9999结果表明芦丁对照品浓度在550gmL范围内与溶液的吸光度之间呈良好的线性关系 2.4.4计算总黄酮含量根据紫外可见分光光度法在510nm波长处测定吸光度值由标准曲线读出浓度计算其总黄酮含量由实验数据得出春飞蓬中总黄酮含量约为0.59% 2.5灯盏花乙素含量测定对照品与供试品溶液均按20XX版药典方法制备按照20XX版中国药典灯盏花乙素含量测定方法测定结果未测出灯盏花乙素 3讨论 春飞蓬原产北美是一种外来入侵植物最近几年在中国南方城市发现但在山东境内发现属首次报道因其植物形态与一年蓬极近似常会被误认为一年蓬可先从形态特征如叶先端的形态、花的开放特点和花期以及毛茸等几个方面仔细加以区别再者可以通过分子鉴定方法进一步区别通过对春飞蓬进行初步鉴定研究表明其粉末中主要显微特征有花粉粒、多细胞非腺毛、螺纹导管、表皮细胞及不定式气孔、纤维、冠毛、花药碎片和茎部薄壁细胞等;从花粉粒扫描电镜图可以看出春飞蓬花粉粒比一年蓬花粉粒的直径小且外壁纹饰的齿状突起更稀疏、更短钝;得到了春飞蓬的ITS序列;紫外可见分光光度法测得春飞蓬全植株中总黄酮含量为0.59%;灯盏花乙素未检测出资料报道全世界飞蓬属植物种类共计200余种其中经过研究的有30多种我国对飞蓬属植物研究较深入的只有短亭飞蓬(