DB21∕T 1906-2011 动物主要疫病病原监测技术规范.doc

ICS65.020.30B 41DB21辽宁省地方标准DB 21/ T19062011动物主要疫病病原监测技术规范Techniques specification for surveying major pathogenic microorganism of- animal disease点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2011年5月20日）2011 - 08 - 19发布2011 - 09 - 19实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准附录AH为资料性目录。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准起草人：魏澍 杨作丰 王竹 孙世宇 邓文超 杨庆民 赵培 秦蓁 薛树山27动物主要疫病病原监测技术规范1 范围本标准规定了动物主要疫病监测病种、监测样品采集、监测样品保存运送、样品编号、采样单、送检单填写、检测方法、检测结果记录与汇总、样品留存的技术要求。本规范适用于辽宁省行政区域内动物疫病病原学监测、疫病诊断的活动。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 GB/T 16551-2008 猪瘟诊断技术 GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术 GB/T 18646-2002 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术 GB/T 18936-2003 高致病性禽流感诊断技术 GB/T 19438-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB/T 22915-2008 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法 NY/T 557-2002 马鼻疽诊断技术 NY/T 569-2002 马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法 SN/T 1686-2005 新城疫病毒中强毒株荧光RT-PCR检测方法 农医发200710号 高致病性猪蓝耳病防治技术规范 3 动物主要疫病病原检测3.1 口蹄疫3.1.1 检测样品牛羊活体采集食道-咽部分泌物（O-P液），猪活体采集鼻腔（咽喉）拭子，屠宰场或死亡动物采集颌下淋巴结。3.1.2 检测方法按GB/T 18935-2003反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或GB/T 22915-2008荧光RT-PCR方法进行。3.2 高致病性禽流感3.2.1 检测样品活禽采集泄殖腔和咽喉双拭子，幼禽、珍禽或野禽可采集新鲜粪便，死亡禽可采集肝、脾、肾、肺、脑、喉气管、泄殖腔等组织样品。3.2.2 检测方法按GB/T 18936-2003反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或GB/T 19438-2004荧光RT-PCR方法进行。3.3 高致病性猪蓝耳病3.3.1 检测样品猪活体采集血清样品，死亡猪只可采集扁桃体、肺脏、淋巴结等组织样品。3.3.2 检测方法依据高致病性猪蓝耳病防治技术规范反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行，对使用活疫苗进行免疫的还应进行病原疫苗株与野毒株的鉴别检测。3.4 猪瘟3.4.1 检测样品猪活体采集血清样品，死亡猪只可采集扁桃体、肺脏、肾脏、淋巴结等组织样品。3.4.2 检测方法按GB/T 16551-2008反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或直接免疫荧光抗体试验（FA）方法进行。3.5 新城疫3.5.1 检测样品活禽采集泄殖腔和咽喉双拭子，幼禽、珍禽或野禽可采集新鲜粪便，死亡禽可采集肝、脾、肾、肺、脑、喉气管、泄殖腔等组织样品。3.5.2 检测方法按GB/T 16550-2008反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或SN/T 1686-2005荧光RT-PCR方法进行，使用新城疫活疫苗免疫的家禽需要进行中强毒株的鉴别检测。3.6 牛羊布鲁氏菌病3.6.1 检测样品牛羊活体采集血清样品。3.6.2 检测方法按GB/T 18645-2002进行。3.7 牛结核病按GB/T 18645-2002进行。3.8 马传染性贫血3.8.1 检测样品马属动物活体采集血清样品。3.8.2 检测方法依据NY/T 569-2002 琼脂凝胶免疫扩散试验方法进行。3.9 马鼻疽按NY/T 557-2002进行。4 样品的采集4.1 样品采集器材4.1.1 血清、全血采集器材5ml/10ml一次性注射器或无菌封闭性好的试管（最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管）、15ml离心管、1.5mlEP管、抗凝剂（0.1%肝素、阿氏液、枸橼酸钠）或盛有玻璃珠的灭菌瓶、采样箱、保温箱、冰袋等。4.1.2 组织样品采集器材a）准备灭菌的解剖器械：剪刀、镊子、手术刀、大刀、斧头等；b) 样品容器：灭菌试管、平皿或自封袋、载玻片、15ml的离心管、1.5mlEP管、保温箱、冷藏容器等；c) 保存液：营养肉汤、30%甘油盐水缓冲液、加抗生素的PBS（病毒保存液）、50甘油磷酸盐缓冲液。4.1.3 采样记录用品不干胶标签、记号笔、签字笔、采样单和采样登记表等。4.1.4 消毒用品酒精灯、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒药品等。4.1.5 人员防护用具防护服、乳胶手套、防护口罩、一次性手套、胶靴、防护镜等。4.2 活畜样品的采集4.2.1 血清样品的采集对采血部位的皮肤先剃（拔）毛，碘酊消毒，75%的酒精消毒，待干燥后采血。采血方法推行生猪站立耳缘静脉或前腔静脉（站立保定、仰卧保定）；牛羊站立式颈静脉、牛尾静脉或乳房静脉采血；禽类翅静脉采血，采血过程严格无菌操作。4.2.2 全血样品的采集全血采集后应直接注入盛有抗凝剂的试管中，立即摇动，充分混合。也可将全血液注入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，立即连续振荡脱纤维蛋白。4.2.3 猪咽拭子的采集采集咽拭子时，应将其仰卧保定，固定头部并将脖子伸长，用适当的器械（例如止血钳等）夹住拭子，用拭子刮取咽部和口腔后部粘液样品，立即将拭子浸入适量细胞培养液或磷酸缓冲液（0.04mol/L,ph7.4）中，密封低温保存。4.2.4 牛、羊-P液（咽食道分泌物）的采集被检动物在采集前禁食（可饮少量水）12h,以免胃内容物反流污染-P液。采样探杯在使用前应在装有0.2%柠檬酸或1%2%氢氧化钠溶液的塑料桶中浸泡5分钟，再用与动物体温一致的清水冲洗后使用，每采完一头动物，探杯要重复进行消毒并充分清洗。采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部1015cm处，轻轻来回抽动23次，然后将探杯拉出。取出810ml-P液，倒入含有等量细胞培养液或磷酸缓冲液（0.04mol/L,ph7.4）的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口，放冷藏箱及时送检，未能及时送检应置于-30冷冻保存。4.3 活禽样品的采集a) 咽喉拭子的采集：将无菌棉签插入喉头口及上颚裂处来回刮35次取咽喉分泌液；b) 泄殖腔拭子的采集：将棉签插入泄殖腔转23圈并沾取少量粪便，再将咽喉拭子、泄殖腔拭子一并放入盛有0.81.0ml加有抗生素PBS的EP管中，剪去露出部分，盖紧瓶盖，做好标记。4.4 病死（屠宰）畜禽样品的采集4.4.1 解剖前检查急性死亡的牛、羊、猪、马等动物，解剖之前应作临床检查，疑似炭疽病的应采血、镜检，排除炭疽病时，方可解剖。动物死亡后应在6h内进行剖检。解剖人员要做好自我防护工作。4.4.2 心、肝、脾、肾、肺、淋巴结等实质器官的采集a) 先采集小的实质脏器如脾、肾、淋巴结，小的实质器官可以完整地采取，置于自封袋中。大的实质器官如心、肝、肺等，在有病变的部位各采取23cm3的小方块，分别置于灭菌的试管或平皿中，要采集病变和健康组织交界处。b) 用于细菌分离样品的采集可用烧红的刀片烫烙脏器表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂金耳伸入孔内，取少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。c) 用于病毒分离样品的采集必须采用无菌技术采集，可用一套已消毒的器械切取所需脏器组织块，并用火焰消毒剪镊等取样，注意防止组织间相互污染。4.4.3 脑、脊髓样品的采集 取脑、脊髓23cm3浸入30%甘油盐水中或将整个头部（猪、牛、马除外）割下，用消毒纱布包裹，置于不漏水的容器中。4.4.4 肠、肠内容物及粪便样品的采集a) 肠样品的采集：选择病变最严重的部分，将其中的内容物弃去，用灭菌的生理盐水轻轻冲洗后，置于试管中。b) 肠内容物样品的采集：烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取肠内容物，放入盛有30%甘油盐水中或者直接将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断。c) 粪便样品的采集：用棉签插到直肠黏膜表面采集粪便，然后将拭子放入盛有30%甘油盐水中。4.4.5 死（屠宰）禽样品的采集死（屠宰）禽样品的采集除按上述方法采集，也可将整个死禽装入不透水塑料薄膜袋或自封袋中或其他容器内。4.5 组织样品采集完后的无害化处理活畜禽、病死畜禽组织样品采集完后，应做好样品外包装和环境消毒以及病死畜禽及其产品的无害化处理。5 监测样品的保存运送5.1 血清5.1.1 血清分离血液在室温下倾斜放置24h后（防止暴晒），待血液凝固自然析出血清，或用无菌针剥离血凝块，然后放入4冰箱48h后，待大量血清析出时，吸出血清。必要时经离心机3000rpm、30min离心，吸出血清。5.1.2 血清的保存运送分离的血清，一般不加防腐剂。血清若在12周内即可检验，可放在4冰箱内保存；如果保存时间较长，应放在-20-80冰箱内保存。运送血清时可将血清放在盛有冰块的保温箱中运送。5.2 全血采集好的全血转入盛血试管，斜面存放，室温凝固后直接放在盛有冰块的保温箱，送实验室。从全血采出到血清分出的时间不超过10h。全血样品只能在4低温保存运送。保存时间不超过1周。5.3 其余病原分离样品将所采集的病原分离样品置于4左右保温容器中在24h内送到实验室。若24h内不能送到，可将采集的样品放入样品保存剂中4或冻存（做细菌分离的样品不宜冻存），样品不宜反复冻融。样品保存剂及配制方法参见附录A。6 样品编号、抽样单、接收样品登记表填写每头动物的不同部位的组织样品应单独包装。包装好后，在样品袋或平皿外贴上标签，标签注明样品名、样品编号、采样日期等。采集好不同部位的样品后，同一动物的样品集中包装。同时填写抽样单和流行病学调查表。抽样单、流行病学调查表、样品上的编号要一一对应。抽样单一式两份，一份由被采样单位保存、一份由检测单位保存。样品送达实验室后，要填写接收样品登记表。抽样单、流行病学调查表、接收样品登记表参见附录B、C1-C4和D。7 样品前处理检测样品到达样品接待室后，由业务管理科室进行样品前处理，并做好登记参见附录E。8 动物疫病病原检测方法动物疫病病原检测采取临床症状、病理变化和实验室检测相结合的方法。9 病原检测结果报告每份样品的病原检测完毕，应按病原结果记录表逐项登记填写。病原结果记录表参见附录F和G。10 样品留存组织样品检测完毕后，需要对组织进行编号留存，填写留样记录表。留样记录表参见附录H。11 附录附录A样品保存剂及配制方法附录B抽样单附录C1-C4. 流行病学调查表（禽、牛羊、猪、屠宰场）等附录D. 接收样品登记表附录E. 制样记录附录F病原检测结果记录表附录G病原结果统计表附录H留样记录表AA附录A （资料性附录）样品保存剂及配制方法A.1 阿氏液（Alsevers）葡萄糖 2.05g柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O） 0.80g柠檬酸 0.055g氯化钠 0.42g加蒸馏水至100ml,溶解后调pH至6.1后分装，70kPa 15min 灭菌，冷却后4冰箱中保存备用。A.2 30%甘油盐水缓冲液甘油 30ml氯化钠（NaCl） 4.2g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 3.1g0.02%酚红 1.5ml蒸馏水（或无离子水） 加至100ml加热溶化，校正pH值为7.6，100kPa 15min 灭菌，冷却后4冰箱中保存备用。A.3 肉汤 牛肉膏 3.5g蛋白胨 10g氯化钠（NaCL） 5g充分混合后，加热溶解，校正pH值为7.27.4，用流通蒸气加热30min，滤纸过滤，获蒿黄色透明液体，分装于试管或烧瓶中，以100kPa 20min 灭菌，冷却后4冰箱中保存备用。A.4 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS ）氯化钠（NaCL） 8.0g磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.9g氯化钾（KCL） 0.2g将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000ml，调pH值至7.4,高压消毒灭菌112Kpa 20min，冷却后，保存于4冰箱中备用。A.5 棉拭子用抗生素PBS（病毒保存液）的配制取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：喉气管拭子用PBS液中加入青霉素（2000IU/ml）、链霉素（2mg/ml）、丁胺卡那霉素（1 000IU/ml）、制霉菌素（1 000IU/ml）。粪便和泄殖腔拭子所用PBS中抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH值至7.4。采样前分装小塑料离心管，每管中加PBS 1.01.3ml，采粪便时在西林瓶中加PBS 1.01.5ml,采样前冷冻保存。BB附录B （资料性附录）抽样单 共 页 第 页 No:单位名称地址动物类别品种总存栏量代次饲养方式电 话传真邮 编检测类别 委托 监检 其他抽样依据抽样方案编号 其他 样品名称样品数量日龄样品编号检 测 项 目备注临床表现免疫项目疫苗名称疫苗批号疫苗生产厂家免疫次数末次免疫时间备 注抽样人： 被检单位：抽样时间： 年 月 日填单说明：1饲养方式应填写规模、散养、市场、屠宰场、野鸟栖息地、其它。2代次：畜应填种畜、商品畜；禽应填祖代、父母代、商品代。 3疫苗类型应填写到亚型。4抽样单位、被检单位各留存一份。CC附录C 1（资料性附录）禽病流行病学调查表序号： 填表日期： 年 月 日 一、基础信息1场/户/养殖小区概况名称启用时间场/户主姓名电话地址市 县（区、市） 乡（镇） 村（场）2调查简要信息调查原因A.日常流调畜主/村防疫员发现 C监测发现 D.其他 调查日期报告日期简述发病情况经济损失3场/户/养殖小区养禽概况（养殖场可不填养殖户数一栏）种类日龄存栏数（羽）养殖户数免疫密度(%)免疫程序疫苗种类、来源(A.政府发放；B.自购；C.无)最近一次免疫时间肉鸡A.春秋防集中免疫；B.常年补免加春秋防集中免疫；C.按程序免疫；D.无。蛋鸡种鸡肉鸭蛋鸭种鸭肉鹅蛋鹅种鹅鸽鹌鹑4混养情况混 养 类 型户 数备注（说明各种混养动物的饲养数量）猪/禽鸡/水禽猪/鸡/水禽其他动物与禽5疫病既往史病名发病日期详细信息（发病、病死、处理等）经济损失二、现况调查1感染禽群情况指标鸡鸭鹅鸽鹌鹑其他： 同群数（羽）*发病数（羽）*死亡数（羽）扑杀数（羽）感染/发病户数*同群数是指与发病动物密切接触的动物数；*发病数是指出现临床症状的动物数。2发病过程时间主要特征新发病数（羽）新死亡数（羽）第1天年 月 日第2天年 月 日第3天年 月 日第4天年 月 日第5天年 月 日第6天年 月 日第7天年 月 日第8天年 月 日3周边野禽、野生动物感染情况种类死亡数（羽）发病数（羽）3病禽临床表现临床症状剖检变化：过去两年是否有类似症状发病情况：A.是 B.否根据临床表现，您怀疑是：A.高致病性禽流感 B.新城疫 C.其它 4采样检测情况样品类型数量检测疾病检测方法检测结果病死禽（羽）泄殖腔/咽喉拭子（个）血样（份）其他6疫点地理特征请提供当地行政区划图，并在地图上标出疫点位置，注明疫点所在地的地理环境特点，如靠近山脉、河流、公路等。如已封锁，请标注封锁范围和时间。7其他信息如有其他信息，如当地的养殖特点、设备设施等与疫病有关需要说明的内容三、疫源追溯追溯期为第一个病例发现前1个最大潜伏期，对所有调入疫点的畜群/畜产品，及与疫点接触的畜/人进行追溯调查。可能来源途径调查日期详细信息（动物品种、年龄、数量、用途和相关地点等）饮水饲料购买家禽本场/户人员到过其他养殖场/户本场/户人员到过活禽交易市场有商贩/兽医/其他从事动物饲养人员到过本场/户有外来交通车辆到过本场/户家禽接触过野鸟放养家禽曾到过湿地和水田人员打猎/曾与野禽接触四、疫源追踪对第一例病例发现前1个最大潜伏期至封锁之日，所有从疫点调出的家禽及产品，及与疫点禽群接触的禽/人进行追踪调查。可能事件调查日期详细信息（动物品种、年龄、数量、用途和相关地点等）出售或赠送家禽出售禽产品兽医人员诊疗饲养人员探亲/串门参加展览/活动流调小组成员签字： 养殖场负责人签字： 县（区、市）动物疫病预防控制中心盖章附录C2（资料性附录）牛、羊病流行病学调查表序号： 填表日期： 年 月 日一、基础信息1场/户/养殖小区概况名称启用时间场/户主姓名电话地址市 县（区、市） 乡（镇） 村（场）2调查简要信息调查原因A.日常流调畜主/村防疫员发现 C监测发现 D.其他 调查日期报告日期简述发病情况经济损失3场/户/养殖小区养殖概况（养殖场可不填养殖户数）畜种存栏数养殖户数免疫密度免疫程序疫苗种类、来源最近一次免疫时间奶牛A.春秋防集中免疫；B.常年补免加春秋防集中免疫；C.程序免疫；D.无。黄牛水牛绵羊山羊4混养情况混养类型户 数备 注猪/羊猪/牛牛/羊猪/牛/羊5疫病既往史病名日期详细信息经济损失二、现况调查1感染畜群情况指 标牛羊其他同群数*发病数*死亡数扑杀数感染/发病户数*同群数是指与发病动物密切接触的动物数。1) *发病数是指出现临床症状的动物数。 2. 饲养与发病畜情况（只针对小反刍兽疫）饲养品种饲养方式同群数发病数死亡数扑杀数康复数病程山羊其中：成年羊羔羊绵羊其中：成年羊羔羊注：1.饲养方式包括圈养、散养、自由放牧和轮牧等情况； 2.发病数和死亡数分公、母两种情况注明。2) 3周边野生动物感染死亡情况种类发病数死亡数4病畜临床表现及剖检病变临床症状：剖检变化：过去两年是否有类似症状发病情况：是 否根据临床表现，您怀疑是： 。5.采样情况样品类型数量检测疾病检测方法检测结果水泡皮O-P液咽喉拭子鼻拭子组织病料血样其他： 6疫点地理特征：如有可能，请在县级行政区域图上标出疫点所在地，并注明疫点所在地的地理环境特点，如靠近山脉、河流、公路等。如已采取封锁措施，请标注封锁范围和时间。7其他信息如有其他信息，如当地的养殖特点、设备设施等与疫病有关需要说明的内容。三、疫源追溯追溯期为1个最大潜伏期，即从发现第一例病例向前追溯1个最大潜伏期，对所有调入疫点的畜群/畜产品，及与疫点接触的畜/人进行追溯调查。可能来源途径调查日期详细信息饲料和饮水购买或引进家畜本场/户人员到过其他养殖场/户或活畜交易市场家畜配种公共牧场放牧跨边境放牧公共奶站挤奶兽医/商贩/其他从事动物饲养人员等外来人员到过本场/户有外来交通车辆到过本场/户与野生动物接触过人员打猎/曾与野生动物接触四、疫源追踪对第一例病例发生前的最大潜伏期内，所有从疫点出售的畜群/畜产品，及与疫点畜群接触的畜/人进行追踪调查。可能事件调查日期详细信息出售/赠送家畜配种参加展览/活动公共牧场放牧公共奶站挤奶与野生动物接触过饲养人员探亲/串门兽医诊疗流调小组成员签字： 养殖场负责人签字： 县（区、市）动物疫病预防控制中心盖章附录C3（资料性附录）猪病流行病学调查表序号： 填表日期： 年 月 日一、基础信息1场/户/养殖小区概况名称启用时间场/户主姓名电话地址市 县（区、市） 乡（镇） 村（场）2调查简要信息调查原因A.日常流调畜主/村防疫员发现 C监测发现 D.其他 调查日期报告日期简述发病情况经济损失3场/户/养殖小区养殖概况（养殖场可不填养殖户数）畜种存栏数养殖户数已免疫苗种类免疫程序相关疫苗来源（厂家、批号）最近一次免疫时间能繁母猪后备母猪仔猪育肥猪公猪4混养情况混养类型户 数备 注猪/羊猪/牛猪/牛/羊5疫病既往史病名发病日期详细信息经济损失3) 二、现况调查1感染畜群情况指 标母猪育肥猪仔猪其他同群数*发病数*死亡数扑杀数感染/发病户数*同群数是指与发病动物密切接触的动物数。*发病数是指出现临床症状的动物数。2发病过程（可另加页）自发现之日起新发病数新病死数第1日第2日第3日第4日第5日第6日第7日第8日3. 周边野生动物感染死亡情况种类死亡数发病数4病畜临床表现剖检病变 临床表现；剖检变化：过去两年是否有类似症状发病情况：是 否根据临床表现和病理变化，您怀疑是何种疫病？ 。5.采样检测情况样品类型数量检测疾病检测方法检测结果水泡皮咽喉拭子口鼻拭子心肌组织肺脏淋巴结扁桃体血样其他6疫点地理特征请提供当地行政区划图，并在地图上标出疫点位置，注明疫点所在地的地理环境特点，如靠近山脉、河流、公路等。如已封锁，请标注封锁范围和时间。7其他信息如有其他信息，如当地的养殖特点、设备设施等与疫病有关需要说明的内容。三、疫源追溯追溯期为1个最大潜伏期，即从发现第一例病例向前