大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项.docx

1. 成年大鼠海马神经元的培养l 步骤1. 获得海马细胞u 大鼠乙醚麻醉，断头处理；u 迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；u 随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；u 将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4的HibernateA/B27的离心管中；u 30震荡8min。u 大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30水域温育30min；u 将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2. 梯度分离u 将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3. 盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.u 细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul 接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；u 将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37 B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；u 培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1. 培养器皿的准备：1） 溶液瓶装配各种溶液输液瓶；2） 螺口瓶血清或培养基；3） 培养瓶细胞培养一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4） 培养皿细胞组织的分离、培养、染色包括直径为30mm、60mm、120mm5） 血球细胞计数板细胞计数6） 移液管连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7） 离心管分离、漂洗、收集细胞一般选用螺口带盖的；Eppendorf塑料尖底带盖的离心管8） 磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。9） 加样器：微量加样器一般采用紫外线消毒：超净台内，3545g,球蛋白20g,血红蛋白越低越好3） 存储：l 新购血清56 30min热灭活（高品质胎牛血清及新生牛血清可不灭活）；l 若一次用不完，将其分装，置于-20，保存612月；l 使用时，从-20取出，置于4 24h（4可保存1月），置于37水域温热；溶解过程中必须规则缓慢摇匀。l 避免反复冻融。(四) 基础培养基1） 认真阅读说明书，注意添加成分；2） 配置时应充分溶解，NaCO3应最后添加3） 配置所用器皿应十分清洁，所用水为培养用水；4） 配置后超净台内过滤除菌，4保存（=6h）注意：酸液呈棕红色，若呈绿色提示酸液失效，应更换酸液；4） 冲洗：方法一：用洗涤装置冲洗；自然晾干；方法二：流水灌满后倒掉（15次）然后蒸馏水冲洗23次;自然晾干；(二) 塑料器皿的清洗灭菌l 塑料器皿一般为一次性使用，拆开包装即可使用，使用后即弃；l 若欲重复使用，可按如下步骤：流水冲净，晾干2%NaOH浸泡过夜自来水冲洗数遍5%HCl浸泡30min自来水冲洗（15遍）单蒸水浸洗3次双蒸水浸泡24h70%酒精浸泡1h超净台紫外线照射1h使用；(三) 胶塞、盖子的清洗自来水浸泡2%NaOH煮沸1020min自来水冲洗56遍1%HCL浸泡1h自来水冲洗56遍蒸馏水漂洗23遍晾干；(四) 手术器械的清洗：纱布拭去表面污物自来水洗净酒精棉球擦拭(五) 注射器的清洗：使用后用来苏水冲洗数次单蒸水洗3次95%酒精洗3次置于铝饭盒中。(六) 滤器的清洗消毒及使用1） 清洗：使用后用清洗液清洗自来水冲洗15min去离子水浸泡24h三蒸水浸泡24h2） 消毒：新的滤膜（每次更换）于双蒸水中浸泡510min，正面朝上置于滤器中，稍旋旋钮（不宜过紧），包装后高压蒸汽消毒消毒后无菌条件下旋紧旋钮行过滤3） 过滤完成后常规打开滤器，核实滤器有无破裂或移动。(七) 包装：1） 培养瓶、培养皿、胶塞、盖子等直接置于铝饭盒中（螺口旋松）；2） 移液管、吸管头端用脱脂棉球将接口端堵塞，置于消毒桶中，桶底部垫纱布；3） 注射器，金属器械用纱布包好后置于铝饭盒中；4） 移液器的吸管头、小滤器置于专用的塑料盒中；(八) 消毒灭菌1） 干热消毒适用于玻璃器皿 160170 90120min2） 湿热消毒适用于玻璃器皿、布类、金属器械、橡胶制品的消毒灭菌金属器械、玻璃器皿、布类15磅 30min；常规使用液体15磅 15min；橡胶制品10磅 10min；湿热消毒后应置于3756的温箱中储存；3） 过滤消毒适用于培养基、消化液及血清的消毒灭菌；4） 经高压蒸汽灭菌，用双层布包裹置于干燥环境中可保持无菌1014d；7. 为了便于固定及染色细胞，可将细胞接种于盖玻片上，盖玻片置于培养皿或培养板中，盖玻片可取出固定染色及封片8. 组织获取：时间尽可能短，保持组织无菌状态，保持组织的湿润。9. 细胞的分离单细胞悬液方法：1） 使用不含Ca，Mg等二价阳离子的平衡盐溶液收集、分散细胞2） 酶消化法： 不用含有Ca，Mg等二价阳离子的平衡盐溶液/含血清或其他蛋白质的溶液溶解酶 控制于适宜的PH环境 消化处理后及时终止酶的活性离心漂洗/加入血清或特殊抑制剂3） 机械吹打法： 吹打口径越小对细胞损伤越大 不时让未离散的组织块下沉，及时收集含有分散细胞的悬液；加入新的平衡盐液重复上述过程 将组织块从吸管中排除时，应将吸管置于液面以上，并贴于试管壁排除避免产生气泡及由此引起的细胞的破裂 要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢10. 培养物的维持：1） 维持于能自动注入空气及CO2的培养箱内2） 保持较高的湿度，减少蒸发3） 温度：维持于略低于37，细胞在39时可迅速死亡4） 换液时间依不同细胞而定。11. 培养板：1) 培养板属于半开放培养，有利于培养箱中CO2的交换。2) 孔直径愈小，细胞聚集现象越明显，24、96孔板这种现象不可避免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指标，如果是MTT ，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。对策：消化细胞时要注意吹打均匀，避免细胞成团；孔内培养液量要足