小鼠骨髓多染红细胞微核试验(氟化钠)

小鼠骨髓多染红细胞微核试验 受试物 氟化钠 微核实验 常用的致突变试验 细胞遗传损伤的指标之一 可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测 化学致突变物 无着丝点断片 整个染色体带着丝粒的环和断片 原理 1有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动 从而遗留在细胞质中 小鼠骨髓多染红细胞微核实验中 微核可出现于多种细胞中 但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分 故常计数PCE细胞中的微核 因为成红细胞发展为红细胞时 主核排出 成为PCE 这些细胞保持其嗜碱性约24小时 然后成为NCE 并进入外周血 在主核排出时 已形成的微核可留在胞浆中 因此 这些在细胞中没有主核 便于观察 观察并计数多染红细胞中的微核 可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况 本试验的测试终点为染色体损伤 PCE polychromaticerythrocyte 多染红细胞NCE normochromaticerythrocyte 正染红细胞 试剂与器材 一 实验动物 成年小鼠 二 试剂 受试物 氟化钠阳性对照物 环磷酰胺 丝裂霉素C 三亚乙基密胺 甲磺酸乙酯 乙基亚硝基脲 小牛血清 使用前pH调至6 4 甲醇磷酸缓冲液Giemsa 吉姆萨 染液 用时 将Giemsa原液用pH6 4的磷酸缓冲液1 10稀释 三 器材 略 实验设计 实验动物 ICR小鼠 体重18 22克 每组10只 雌雄各半 随机分组剂量分组 原则 最高剂量可选用动物的最大耐受剂量或化合物LD50的50 不能引起明显的骨髓抑制 即PCE PCE NCE 不低于对照值的20 因为骨髓发生抑制时 外周血会发生反流 氟化钠 LD50 224 9mg kg 1 21 41 8 11 25mg ml5 625mg ml2 8125mg ml 0 1ml 10g NaF 90mg 8ml 11 25mg ml 4ml 4 4ml 5 625mg ml 4ml 4 4ml 2 8125mg ml 三 染毒途径 灌胃 四 染毒次数及骨髓采样时间 一次染毒 间隔24小时两次染毒 多次染毒应于最大敏感期取样 预实验 本次实习采用一次染毒 24小时后取样测定 操作步骤 24小时后 制片 染色 镜检 染毒 取材 取骨 擦净血污 剔去肌肉 剪去骨骺端 小牛血清 混匀 推片 吹干 甲醇中固定2min Giemsa染色液染色10 15min pH 6 4 pH 6 4 冲洗 晾干 镜检 细胞计数 镜检 先在低倍镜下观察染色及细胞分散情况 再以油镜计数每例样本计数1000个PCE 记录有微核细胞数 一个细胞中有几个微核时 记为一个有微核细胞 再计数200个红细胞 记录PCE在总红细胞 PCE NCE 中的比例 作为对细胞毒性的指标 MN MN NCE 图1 正常嗜多染红细胞PCE 400 图2带微核嗜多染红细胞MNPCE 400 结果分析与评价 结果分析与评价 结果分析与评价 用统计学方法检验微核细胞率的差别Kastenbaum Bowman统计检验表泊松分布二项分布t检验单因素方差分析一元线性回归分析 结果分析与评价 结果判定 实验组微核细胞率比对照组有显著增加 并有剂量反应关系 可认为是阳性结果 阴性对照组小鼠的微核细胞率一般不超过3 若微核发生在雌雄间有明显差异时 需按照性别分别进行统计分析 PCE PCE NCE 不低于对照值的20 PCE NCE为评价细胞毒性的指标 受试组PCE NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大 试验结果不可靠 正常的PCE NCE比值为