111116一站式GST标记蛋白质微量纯化套装使用手册V1点0.doc

蛋白质研究CAT#：111116A-20 CAT#：111116B-20常温运输和保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需要低温运输，-20保存一站式GST标记蛋白质微量纯化套装one-Stop GST-Tagged Protein Miniprep Pack使用手册V1.0北京天恩泽基因科技有限公司北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室QQ:944823743，449730601（销售），948393554（技术），电话：010-62200278（销售）技术），原理及特点重组蛋白N端的GST谷胱甘肽S转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的，具有下列特点：1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达GST标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的GST标记蛋白。4. 每次可以处理20 mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。5. 提供2 mL 谷胱甘肽-Agarose介质，可吸附5-10 mg GST标记蛋白质。6. 本介质可以反复使用多次。规格及成分成份20次小盒包装A型（111116A-20）20次小盒包装B型（111116B-20）谷胱甘肽-Agarose介质2 mL2 mL10PBS缓冲液（CAT#:100215-100）100 mL100 mL溶液A1 mL无GST洗脱缓冲液成分一25 mL25 mLGST洗脱缓冲液成分二约80 mg约80 mg溶菌酶（20 KU/mg）无30 mgBenzonase（2U/uL）无20 uLPMSF（10 mg/mL）0.5 mL0.5 mL6 mL层析柱(带筛板)1套1套使用手册1份1份运输及保存常温运输和保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需低温运输。收到货后，介质需4保存，溶菌酶、Benzonase和PMSF需-20保存，有效期一年自备试剂超纯水使用方法注意：1. 每步得到的样品最好都留存少量作为SDS-PAGE分析的对照，在下面描述中就不再提醒。2. 本实验需要用到的1PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10PBS缓冲液而得。PBS缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。3. GST洗脱液的配制方法是将约80mg GST洗脱液成分二全部加入到GST洗脱液成分二中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST洗脱液，分装成小份放-20保存，每次用一管。一:重组蛋白的表达和细菌收集1. 37振荡培养20 mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。2. 加IPTG到终浓度为0.1 mM，30振荡培养3小时或22振荡培养8小时（或过夜）。3. 4 5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液，弃上清。4. 用1PBS缓冲液重悬细菌沉淀，4 5000 g离心10分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80保存。二：细胞裂解5. 如果用本产品A型，用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（1 mL 1PBS缓冲液+50 uL溶液A+ 25 uL 10 mg/mL的PMSF溶液）重悬细菌沉淀，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选1K-10K频率处理15次，每次20秒，间隔1分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。6. 如果用本产品B型，用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液和25 uL 10 mg/mL的的PMSF溶液以及1 uL Benzonase，重悬细菌沉淀，重悬后再加入，冰上放置30分钟。细胞裂解液配制方法是将25 mL 1PBS缓冲液和30 mg溶菌酶干粉混合，溶解后分装成1 mL/管，没用的部分放-20保存。7. 将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性GST标记蛋白。三：层析柱的制备和GST蛋白纯化8. 摇晃将谷胱甘肽-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据GST蛋白产量决定，100 mL菌液一般使用200 uL介质即可）。下列步骤各溶液的用量均针对200 uL介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。9. 用5 mL 预冷的1PBS缓冲液洗柱。10. 将第7步得到的上清液（含可溶性GST标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在0.2-1 mL/分钟即可。如要提高GST标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。11. 用0.5-2 mL 1PBS缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）。12. 用0.2-1 mL GST洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含GST标记蛋白）。由于可能含蛋白酶污染，所以穿透液不能在4放置，需立即用于后续处理（如浓度测定或SDS-PAGE电泳）或-80长期放置。13. 对收集的2种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或SDS-PAGE分析。注意：如果不预先脱盐，则只能用Bradford法或OD检测法（1 OD280约等于0.5 mg/mL蛋白）测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于GST的分子量为26 KD，所以在SDS-PAGE胶上，GST标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。附：GST柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）1. 用3倍体积的6 M盐酸胍处理柱子10分钟。2. 用3倍体积的超纯水处理柱子10分钟。3. 用3倍体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子10分钟。4. 用3倍体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子10分钟。5. 再重复3-4步两次。6. 用3倍体积的超纯水处理柱子3次。7. 用3倍体积的1PBS缓冲液处理柱子2次。8. 堵上漏口，加3倍体积的1PBS缓冲液待用。若长时间不用，则第7步和第8步的1PBS改成20%的乙醇。疑难解答Q：为何GST蛋白不