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文档简介

Northern Blot实验方法1、 胶的配制(试剂盒中已有)2、 样品配制 试剂 加样量RNA loading buffer 3LmiRNA 7L将微量离心管盖严，将RNA溶液置于70温育5分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。3、 凝胶电泳用0.5X TBE作为电泳缓冲液，预跑空胶（撕下空胶板底部封住的胶布，为了使其通电），60V（恒压）,30min。加10L RNA样品到一个15%尿素聚丙烯酰胺凝胶，留出两边最外侧的加样孔加入5RNA分子标准样品作为Marker。注：不同的RNA样品可以被加载到凝胶与一个单一的miRNA探针或相同的检测60V（恒压）运行，直到溴酚蓝达大约距离凝胶底部3厘米的处停止，大约两小时左右。4、 转膜1、转移凝胶至充满0.5X TBE缓冲液的玻璃盘中。2、提前将膜与滤纸浸泡在0.5X TBE中半小时。3、组装转膜装置：一个纤维垫，一个滤纸，凝胶，膜和一张滤纸，一纤维垫4、确保凝胶在负极侧，膜在正极侧的一面，转移盒里倒满预冷的0.5xTBE。6、60V，在寒冷的房间或冰箱里转移1小时7、转移后，RNA用紫外交联仪固定8、在42干燥15分钟。(若无条件，7、8两步可以省去。)5、 杂交1）膜放入杂交管（科宁50毫升的一次性管）。（2）利用dH2O泡膜，然后倒去dH2O（3）放入预热的NB hybridization buffer 4 毫升（预热到42）。（4）转动杂交管42 ，30分钟（5）倒掉缓冲液，加入新鲜的预热的NB hybridization solution4毫升（预热到42）（6）加10L RNA探针，42杂交过夜。（7）用20ml 1xNB hybridization wash buffer.在瓶中冲洗膜。（8）添加NB hybridization wash buffer 20毫升，42旋转30分钟。6、 检测（1）用镊子将膜转移到杂交管容器（200mL杂交管）。每个管里可以有一个完整的膜或者两个一半大小的膜（在后面所有的孵育步骤中不能使膜重叠。（2）用10ml 1X Detection wash buffer洗膜。（3）用15ml Blocking buffer封闭膜，室温，30分钟适度摇晃。（4）用1ml 1X Blocking buffer 稀释15L辣根过氧化物酶标记的亲和物，转移到容器。不要把酶稀释液直接加到膜上。（5）室温下持续振动膜45分钟。（6）倒出封闭缓冲液，用1x Detection washing buffer 15ml 洗三次（室温），每次洗涤10分钟（7）等量混合底物A和B，将膜放在检测板上，用1.8ml底物溶液覆盖膜，盖上压片膜，确保底物均
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