细胞工程应用技术(备份).doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除第 三 篇 细 胞 工 程 的 应 用 技 术 第23章 细胞的大量培养近年来细胞工程的相关技术发展十分迅速,尤其是在实际应用和生产工艺上获得了可观的成就,当前人们已经能够通过大量细胞培养的细胞工程,生产多种单克隆抗体,激素,细胞因子,病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等.因实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限,不能满足生产的需求,必须改用超产培养技术方可获得大量细胞,目前这种技术种类繁多,归纳起来有三大类:(1)单层静置贴壁培养法;(2)悬浮培养法;(3)固定化培养法.这些超产培养技术通常是研究开发机构及生产性企业常采取的方法,在我国已开始进入研究和试生产阶段,各大生物制品研究所及生化制药和生物工程公司的制药企业,根据生产需要而采用了切实可行的不同方法和技术设备.下面介绍一些有关细胞大量培养的方法(如图23-1),在实际应用和生产实践中可根据需要来选择下列细胞大量培养的方法.转管及转瓶培养单层静置贴壁培养 旋转园柱管培养1.多层繁殖器细 2.多层托盘式装置胞 多层培养 3.Opticell培养系统大 4.塑料软片培养系统量 5.Heli-cel薄膜卷带式培养培 固定化培养 养 微载体培养的 中空纤维灌注培养方 玻璃珠床培养法 包被细胞培养翻滚培养 旋转培养悬浮培养 电磁搅拌培养振荡培养振动器培养滋养器装置 搅拌生物反应器发酵罐培养 气动发酵器第一节 培养要素控制及其参数的测定一,细胞的定量测定(一)细胞数量的测定:采用常规细胞计数法(见前第一篇第九章第四节)测定细胞总数及活细胞数,并计算细胞存活率.(二)细胞活性的测定1,直接测定:计数法中的细胞存活率的测定虽能显示细胞的生长活力,但误差大,故常采用MTT法或3H-TdR掺入法可准确地显示细胞的代谢状态和生长繁殖的活力.(方法见第一篇第九章第五节)2,间接测定细胞活性间接测定法是基于测定细胞代谢活性之上的.最为普通的参数是葡萄糖的利用及生物氧化后的代谢产物,如乳酸或丙酮酸产物等.(三)培养要素控制1,容器生长表面的选择和处理(静置贴壁培养)-细胞培养容器的生长表面为玻璃,不锈钢(或钛),塑料表面.玻璃应选用明矾-硅硼酸钠玻璃(例如Pyrex),反复使用会减少细胞的贴壁,用1mmol/L醋酸镁处理能获恢复;塑料表面常用聚苯乙烯,此外还可用聚乙烯多聚碳酸盐,Perspex,PVC聚四氟乙烯(Teflon)玻璃纸及醋酸纤维素等,经正确预处理后都是合适的.不锈钢(或钛)对细胞生长是合适的,但处理和清洗时要用酸洗(10%硝酸,3.5%氟氢酸,86.5%水)以利除去表面污物.为了利于细胞贴壁,培养表面要求使用糖蛋白和/或二价阳离子(Ca+,Mg+)交联,研究最多的糖蛋白为纤粘素.培养表面也可用胶原以及多聚氨基酸覆盖壁表面.胶原可以购买(Vitrogen100,F10w实验室),胶原在生长表面对细胞生长有利,也可用于覆盖微载体小珠表面(Cytodex3,Pharmawa Fine Chemicals).2,悬浮培养基中的添加剂(1)通常将羟甲基纤维钠(纤维素)(520e.p.s)加入悬浮培养基中(0.11%浓度)以防止搅拌,通气和灌注时对细胞产生机械损伤(预先应做毒性预试验).(2)通常将pluronic F=68(polyglgcol)(BASF,wyandot)消泡剂加入培养液中(0.11%浓度),可防止血清在搅拌通气中产生泡沫,此物质也可阻止细胞贴壁(预先应做毒性预试验).3,培养条件(1)温度 适宜温度为37,通常选择360.5上下波动进行控制,培养液要事先预温,以利细胞适应环境.(2)pH 理想的pH值为7.2,开始培养时pH值可略低一些,次日细胞开始快速生长时可将pH调至7.4已进行控制,常加入Hepes以稳定pH.(3)细胞生长期的选择 应选择细胞对数生长期后期的细胞接种培养,以利细胞生长繁殖.(4)接种细胞密度 细胞接种密度要根据细胞系种类的特性以及培养基而定,指导浓度为51042105细胞/mL或51032104细胞/mL.(5)搅拌速度 不同细胞应通过实验找出合适的搅拌速度,对于悬浮细胞可用100500r/min,通常在200350 r/min 之间,而微载体培养细胞通常使用20100 r/min 范围之内.4,培养基和营养物质的选择悬浮培养常用Eagle(BME或MEM)血清成分为25%,但谷氨酰胺需不断补充,同时可补充胱氨酸,精氨酸,培养23天后还应补加葡萄糖以利细胞稳定生长,若为了加速生长可在培养基中加入适量生长因子,激素等,如:胰岛素(5mg/L),转铁蛋白(535mg/L),胆胺(20mol/L)及硒(5g/L)等,Ca+,Mg+应尽量降低,以防细胞结团,贴壁,下沉,也可采用补加胰蛋白酶(2mg/L)可以克服.5,培养系统的控制(1) pH调控系统不同培养液其缓冲系统不同,Eagle BSS(含25mmol/L NaHCO3)要选用5%CO2来平衡(通气口均安装气体过滤器,以防污染),培养系统中常安装有经高压灭菌的pH 检测探头,将信号输入控制器,然后换成数字或类似的pH 显示,这是一种pH 监测系统,pH 调节是由pH 值调控板上的高或低点的接点,接通后能起动泵或螺线管活塞上的中继器,使酸或碱(5.5%NaHCO3)自动加入培养液中以调整pH ,加入时应提高搅拌速度,以防局部浓碱损害细胞,在通常情况下是通过调节5%CO2/95%O2的比例来调节pH ,为了使pH 保持较高的缓冲能力.通常加入Hepes.(2)通气调控系统正常情况下氧只溶于培养液中(7.6mg/L),而106细胞1小时平均耗氧6g,这样培养液中的溶介氧若接种106细胞,1小时就会耗尽,因此在1L大瓶的密闭培养时,培养上方的空间与培养液的比率为10:1(如Roux瓶)以提供足够的氧,即在Roux大瓶中有900mL空气和100mL细胞培养液,开始氧的含量是0.27g(见表3-1),这样的含氧量可以支持108细胞生长450小时,显然是很合适的.气态氧向溶液中溶解,氧弥散到细胞的速率大约是1.5g/cm2/h,以此速率足以能支持1L瓶中50106细胞对氧的需求.由此可见维持较大的上方空间是很重要的.表23-1 Roux培养瓶气相和液相氧的浓度在900ML空瓶中的氧在100ML培养液中的氧9000.2132/22400=0.27g1007.610-4=0.0076g注:0.21为氧在空氧中的比例 32=氧的分子量22400为克分子数,7.610-4为氧与空气平衡时37水中氧的溶解度.在深层培养细胞时,就不可能使培养液上方留有如此大的空间,靠间歇通气,通过气体扩散装置或通过细长薄壁管的膜,行气体扩散,使氧溶解于培养液中,或采用特殊的连续灌注系统,使培养液通过氧小室后再转回罐中,此法还可使培养液在小室内添加NaHCO3调节pH .目前常在培养罐内上方的空间,通过升高氧压来增加溶解氧的浓度.在40L生物反应器试验中,加氧方法不同,氧溶解效果和可维持的细胞量是不同的,结果如表23-2.表23-2 40L生物反应器加氧方法(30L工作体积,外观比例1.5:1)加氧方法氧的分送(mg/L/h)维持细胞数(106/mL)空气(10mg/L/min,在40r/min)(1)表面通气0.50.08(2)直接扩散4.60.76(3)旋转过滤扩散3.00.40(4)灌注(1体积/小时)12.62.10(5) (4)+(3)15.92.65氧(10mg/min,在80 r/min )旋转过滤扩散51.08.50(3)+(4)92.015.00假定氧利用率为26g/106细胞/h通入氧气若浓度过大,细胞也会产生氧中毒,同时pH也会上升至7.6以上,因此通气时不仅应调整好CO2/O2的合适比例,而且还应通过调节氧化还原电极(不是氧电极)控制氧化还原势能(ORP),以控制氧的供应.通过氧化还原势能显示也可用于预测细胞生长的对数期,这是因为对数生长期细胞氧化还原值下降.而且在平衡期大约24小时达最小值(如图23-2),此时就告诉我们此时的细胞需要更换培养液.图23-2 与细胞生长和葡萄糖利用相关的ORP的变化(6)ORP最小值出现在对数生长末期(A)前24小时.第二节 细胞大量培养的类型和方法大规模培养系统的类型.为了获得大量的细胞常采用批量和连续的培养系统.细胞接种在固定体积的培养液中,由于细胞生长营养物的耗尽和代谢产物的积累,细胞最终会停止生长繁殖,使细胞的密度受到了限制.为了延长细胞的生长周期,采用添加或更换培养液,或扩大培养体积,可增加细胞的产量.常采用如下措施.(1)逐渐加入新鲜的培养液,故增加培养体积(批量换液).(2)使用等量新鲜的培养液间隔地更换部分旧培养液成分(半连续批量培养系统).保留下来的部分旧液不仅对细胞生长无害,有时还有利于细胞更适应环境.(3)用连续灌注法加入培养液.将回收使用过的无细胞等量培养旧液,先经过第二容器,并在第二容器中经通气和pH校正处理后,形成再生的培养液,然后再反回进入原细胞培养器中.(4)连续-流动培养系统(如图23-3)这一系统是当接种的细胞在固定体积的培养容器中培养,直至生长到限制营养所能支持的最大数值,即培养至稳定状态时(此时细胞数和营养浓度保持恒定),此时将细胞悬液流入恒浊器.恒浊器装有细胞密度(浊度)光电测定仪,当密度低于预定点时,储罐中培养液的供应便停止,细胞不断增殖.当细胞密度高于预定点时,则输入培养液洗出过剩的细胞,这种调控法均在细胞达最大生长率时进行操作,这种连续-流动培养系统可得到真正内环境稳定的条件,而且又没有营养,代谢或细胞数量的波动,可使细胞一直处于对数生长期状态,其生产规模可呈无级连续扩大.图23-3 连续流动培养系统C.水箱保温培养容器;WB.水浴及循环系统;O.流出容器;R.贮液库;P.泵S.取样装置;F.流量测量计;M.电磁驱动器.二,大规模生产细胞的方法大规模生产细胞的方法多种多样,鉴于细胞的生长特性不同(贴壁或悬浮生长)和生产的目的不同,常采用三种生产方式:(1)单层静置贴壁培养法;(2)固定化培养法;(3)悬浮培养法.在这三种生产方式中,又可采用不同的生物反应器来生产细胞.(一)单层静置贴壁培养法此方法是使细胞静置贴在容器壁表面,并不断地生长繁殖而形成单层.在显微镜下可直接观察到细胞的形态,这样有利于研究形态学的变化,如病毒感染后出现的细胞病理性改变(CPE),放射线或抗癌药物引起的细胞形态变化及细胞诱导分化的形态改变等.几乎各种细胞,包括原代,传代细胞系(株),均能进行培养,其优点为:(1)单层细胞培养比较容易完全换液,而且细胞清洗方便,无需离心.(2)便于直接观察细胞的形态和生长状态.(3)便于采用灌注技术,以达高密度细胞培养的目的,固无需采用细胞过滤系统(为了截留细胞用).(4)当细胞贴壁于基质,能有效地表达一种产品.(5)同一装备可使用不同的培养液/细胞的比例,在进行实验期间这一比例可容易地加以改变.(6)单层细胞培养较易适应环境,可用于培养所有的细胞类型.但单层细胞培养法与悬浮细胞培养法相比也有以下缺点:(1)传代,扩大培养比较困难,生产规模受限制.(2)细胞取样,计数较困难.(3)在测定和控制pH和O2以及细胞完全同质性是比较困难的.(4)占用的空间大.(5)所用培养瓶(管)因瓶(管)口多,传代换液需开口操作,容易发生污染.1,转管及转瓶培养转管培养法(roller tube culture)是Gey提出的,实验室常用,为了扩大细胞产量,将试管改用转瓶,故称转瓶培养,其培养方法是一样的,试管或转瓶固定在支加上,倾斜度为510左右,或将转瓶放在一排排转轴之间,使转瓶随着转轴以每小时612转缓慢转动.细胞贴附于玻璃壁四周,细胞贴壁和生长只有一个表面面积,经转动一方面使培养液流动,利于细胞吸收营养和进行代谢,一方面使细胞有机会接触气体,有利于细胞呼吸和发生氧化还原作用,有利于细胞生长繁殖.培养瓶(管)内保持有相当大的上方空间,以维持合适的氧和pH 水平,通过转动可使细胞交替接触培养液和空气,营养可被充分利用.若需增加细胞产量,除可在增加转瓶的数量和容积外,使瓶直径尽可能小,此时表面面积可因直径或长度的倍增而成倍增加.转瓶培养也可使用灌注培养系统,因此系统需要错综复杂回旋的可连续供应的管道进入瓶内,这是一种昂贵的选择.实验程序:本程序是在1400cm2(2312cm)一次性塑料瓶上使用的(Corning或Becton Dickinson)程序.(1)加入300ml生产培养液于转瓶中.(2)加入1.5107细胞.(3)在37下,以12转/小时,转动2小时,使细胞均匀贴壁.(4)减少转动速度至5转/小时并连续培养.(5)在倒置显微镜下使用长焦距物镜检查细胞.(6)在细胞生长至明显汇合时(56天),移出培养液,加入0.25%胰蛋白酶,并滚动转瓶以收获细胞.洗去胰蛋白酶,加入新鲜培养基,可转入扩大再培养.为了增加表面积,有人将转瓶表面制成带皱纹的表面或插入多层隔板.以增加表面积.2,旋转圆柱管培养这个系统是Stantere首先提出并由Corbeil发展的,这是一种用小玻璃管束平行排列包裹在圆瓶内(用硅隔离环隔开),由一个多岐管与各束管连通制成一个大转瓶,此装置因体积大,可放在温室内培养细胞,使转瓶呈水平位置,以46转/小时的转速沿纵轴旋转.细胞可在每个玻璃管壁四周贴壁生长.支架上装有一个显微镜,操作者可观察至圆柱管内细胞的生长.pH 可自动调节(通过多岐管龙头加入NaHCO3),细胞呈单层后,不能传代,但可用于病毒感染,生产疫苗等.生产规模,根据可利用的表面面积划分,有5103 cm2 ,1104 cm2及1.5104cm2.培养液由贮液灌提供,故便于采用灌注培养系统.生产3.2109Vero细胞(2.3105/cm2)是在10000cm2的培养系统中使用6.5L的培养液(以50ml/分灌注)培养6天后收获.后来Gyrogen又进行了改良,将转瓶改用不锈钢圆筒,并备有倾斜支架,显微镜检查和消毒灭菌装置.(二)固定化培养法将细胞限制或定位于特定空间位置(不只是贴附在一个表面面积上)的培养技术称为细胞固定化培养.固定化培养方法有贴附法和包埋法,贴附法是将细胞贴附于玻璃板,金属板,塑料膜,陶瓷珠及硅胶颗粒的表面,或附着于中空纤维膜及培养容器的表面;包埋法是将细胞包埋于琼脂糖,胶原及血纤维等海绵状基质内进行培养,其优点如下:(1)易于更换培养,易于进行灌注培养,无需外加细胞滤器.(2)细胞和培养液易于分离,也易于对细胞进行洗涤处理.(3)培养的细胞密度大,易于制备高浓度,高效价的细胞工程产品,可大大简化产品分离纯化的操作程序.缺点为:细胞难以传代和进行扩大生产,只能用于一次性产品制备,生产规模受限,难以开展逐级放大,达到工业化生产规模.目前已经研制开发出的细胞反应器装置多种多样,有多层繁殖器,多层托盘培养器,螺旋卷膜培养器,卷带式培养器,中空纤维,微载培养及流化玻璃珠床反应器,除后三者外,其它装置用于细胞培养时需另加配套设备方可进行规模化生产,而且为手工操作,目前还缺乏工业化生产的配套设备.1,多层培养法(1) 多层繁殖器(如图23-4)为了增加细胞产量,必须增加贴壁细胞生长的表面.可采取多层培养法,以提供大量的细胞生长面积.Weiss和scheicher设计了一种多层繁殖器,放在温室中培养.该容器是在一个大的不锈钢或玻璃制成的发酵罐内,装有一层层间开叠加的玻璃板,在玻璃板旁边的近罐壁插有通气管,以便通入空气和CO2混合物,罐盖上设有加样管口,此管伸至盖下方的罐架附近,另有一根采样管伸至近罐底,以便加样,采样和循环培养基,也便于维持和调节pH.容器底部有电磁搅拌器,使加入的样品(病毒或诱导剂)能通过搅拌而均匀分布,与细胞充分接触.细胞在玻璃板上生长,通过控制通气速度和CO2/O2混合物的比例来控制pH 值,O2和CO2量.温度控制靠温室的温度控制(一般为35),或罐壁夹层通入流动的37循环水,细胞生长情况通过测定pH 值和葡萄糖利用来确定,也可用一个长距离的透镜潜入培养基中,在玻璃板层面上逐层对细胞进行显微观察.细胞长成单层后,倒出生长液,经洗涤后用于生产病毒,疫苗和制造生化产品如IFN-等细胞因子.目前在该多层繁殖器中培养的细胞有新生牛肾,非洲绿猴肾,鸭胚,鸡胚纤维母细胞,人胚肾原代细胞,人胚肺(WI-38)和新生儿包皮(HF)二倍体细胞,BHK21和CCL-1等传代细胞,用来培养腮腺炎,风疹,鼻病毒和呼吸道合胞病毒,此培养系统还能用于生产干扰素和尿激酶.此培养系统的优点为:设备简单,单位体积的细胞生长面积大,培养基的体积和玻璃板的间隔可自行调节,O2,CO2,pH 值等容易控制,并可减少污染,节约空间和劳动量等.缺点是气体和培基循环搅动效果较差,深层玻璃板上的细胞生长没有上层好,此外所用培养基用量大.(2)钛碟装置 多层玻璃板可改用钛碟圆盘替代,并能使其旋转的培养装置称钛碟装置,即在10L圆柱状不锈钢(带有观察条件)罐内或玻璃瓶内装入钛碟圆盘,于每个钛盘上接种细胞(5105/mL).开始接种时,用细胞悬液充满容器,使钛盘处于水平位置,静置贴壁24小时后,取出一部分培养基,留下1/2的培养基时,然后将罐体转90,使罐体处于水平位置,钛盘置于垂直位置,1/2细胞层面浸没在培养基中,以0.5转/分的速度旋转钛盘,直到细胞长成单层,用此法培养人胚肺二倍体细胞,经34天细胞数可增加7倍.钛盘也可用玻璃盘代替,培养方式可旋转培养,也可静止培养,这种系统比上述有所改进,无需磁力搅拌,而由钛盘旋转替代,可克服上述培养方式的不足之处,即气体,培养基循环效果好,无层间细胞生长差异,而且可节约培养基.采用此法培养的细胞如L细胞,HeLa细胞等,细胞数量比采用转瓶培养增加了近10倍,并用L细胞制备了干扰素.总之,多层表面培养法主要是一次性扩增大量面积,以使贴壁细胞的增殖量大量增加,以生产大量的病毒或其病毒疫苗及细胞合成的生化产品,可扩大产量,但细胞传代培养有一定难度.A.多层繁殖器 B.钛碟装置C.多层园盘式 D.多层托盘式1样口;2.取样口;3.进气口;4.出气口5.盖板;6.底板;7.平板;8.隔板支架9.电磁搅拌(电动搅拌)器图23-4 多层培养装置(3)多层托盘式装置 此装置与多层繁殖器结构类似,只是将多层繁殖器中的细胞贴附的平板,改换成彼此独立的类似于大平皿样的托盘,细胞和培养液置于托盘上,每层托盘的培养液上方均有较宽的空间,便于气体交换,可有助于解决多层繁殖器中底层细胞生长不佳的缺点,无深层差异,细胞生产良好,但无法使细胞传代,只可用于终末产品的制备.(4)opticell培养系统 这个系统包括一个圆柱形陶制外壳(可利用的培养表面积在0.412.5m2之间),内装有许多1mm2四方管道,提供了一个大的表面积.它与培养体积之比为40:1,可采用灌注培养系,可使培养液流至贮液罐,在那里进行环境控制(通气及调pH ).这种系统无法使细胞传代,但可用于病毒及细胞表面抗原和单克隆抗体的生产.在单个控制培养单位中用平行排列的多皱表面的管道扩大培养面积至210m2是完全可能的.多皱表面对悬浮和贴壁细胞都是可利用的.(5)塑料软片培养系统培养的袋子是由荧光乙二胺丙烯异分子聚合物制造的(FEP-Teflon, Du Pont),它具有生物隋性,对细胞无毒,但很透气,因此一个5 cm30cm的塑料袋中加入210mm深的培养液及细胞,便可放入温箱中培养.氧的供应是充足的,细胞在袋内表面生长与空气只隔开25m,可获高密度生产的细胞,通过摇动或在转动条件下培养,可以保持培养液的均质性,细胞也可采用胰蛋白酶消化或用折叠,以及伸展袋子的机械法使细胞脱落.塑料软片繁殖器是一种复杂的设备,也使用FEP-Teflon材料制成空心软片管来替代袋子.空心软片管长达10m可围绕容器中的卷轴将其缠卷,培养液加压通过管子或进入灌注培养贮液罐,进行环境调整,细胞在软片内壁生长,此培养系统可获表面积达25000cm2,可用于细胞大量培养.(6)Heli-Cel(Sterilin)薄膜卷带式培养此培养系统是采用聚苯乙烯制成的螺旋形多孔薄膜带(3mm510mm100mm),呈螺旋状管道或缠卷状管道,装在大型培养器中,这样就可以获得高的面积/体积比率,膜间空隙为4mm,用泵使培养液通过培养器进行循环流动,以供膜表面细胞生长,总面积可达800cm2 .用不锈钢或塑料桶作容器,顶上装有螺旋盖,并附有入口和出口,可供通气或液体流动,因膜带是透明的,也可从培养容器上观察窗进行细胞检查.此装置又称薄膜培养器,有人采用此培养系统培养杂交瘤细胞,85天可产生近1g单克隆抗体.现已发展成大规模培养薄膜生物反应器(Membro ferm MBR生物反应器).2,微载体细胞培养法(如图23-5)微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期,最早使用离子交换凝胶(DEAE-Sephadex A50)作为载体,轻微搅动即可悬浮在培养基中.由于这种微载体带有电荷,利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖.载体处于悬浮状态时,这样既可大大增加细胞附着面积,又使细胞能与培养基充分接触,进而有利于细胞的生长,因此能达到大量培养细胞的目的.后来根据细胞附着生长的特点,对微载体进行改良,使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长.这一方法既可用于常规量的培养,也可用于大规模培养细胞.事实上这是单层培养与悬浮培养相结合的方法,细胞对载体介质是贴壁静置培养,但载体介质又处于悬浮状态而使细胞处于悬液培养基中.该方法具有操作简便和不易污染的优点,利用此法已成功地用猴肾细胞(Vero细胞)生产疱疹病毒疫苗和用培养的人二倍体细胞(人胚肺)生产出人干扰素.此外还培养了狗肾,兔肾,牛肾细胞,鸡胚纤维母细胞,WI-38,MRC-5,BHK21,IUP-90,F10W,2002,人包皮FS-4二倍体细胞,鼠胚,猩猩肝成纤维细胞等传代细胞.图23-5 微载体培养装置结构图(1)载体的性质和改进:载体选择应以利于细胞贴壁生长,又无毒性为原则,然而离子交换凝胶作为载体存在许多缺点,如在一定程度上对细胞有毒性,对培养基的pH也有一定影响,因而近年来对载体进行了改良,目前使用的载体主要有三种类型,它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子,分别为,型(Cytodex 1,2,3).由于微载体所带有的基团不同,就决定了它们之间的差异,I型载体是整个载体带正电荷,II型仅表面带有正电荷,型不带有电荷,其外表面被胶原层包裹,胶原是豚鼠皮肤的提取物,同样适于细胞附着和生长,它们的物理性质如表23-3.表23-3 微载体的物理性质密度(g/mL)1.031.041.04直径(m)d50180155175d595131220114198133215表面积(cm2/g)600055004000数目(个/g)6.81065.81064.0106膨胀系数(mL/g)181514微载体比离子交换凝胶有明显的优点:大小和表面性质更适宜细胞生长;具有一定的透明度,便于显微镜观察;无毒性,适于各类细胞附着生长.尤其对附着性差和存活率低的细胞更适用,一般,型优于I型.(2)微载体细胞培养方法用微载体进行细胞培养的主要问题是选择合适类型的微载体和适宜的搅拌速度,应先根据不同的细胞对三种载体进行预试验,选择合适的载体和搅拌速度,以使载体上能贴附最大量细胞为依据,此外,因微载体本身对蛋白质有一定的吸附能力,它们的吸附率分别是总蛋白的4.3%,2.7%,1.1%,故使用血清的量最好不低于10%,示细胞贴附生长而定. 微载体的选择 先利用三种小量微载体的培养瓶做培养试验,观察细胞在一定时间内细胞的附着率和计算细胞数,以得到最大量细胞为佳.通常是绘出生长曲线,以比较它们容纳细胞量的大小,微载体的用量和搅拌速度等.搅拌速度以能使载体完全悬浮在培养基的效果为最佳.微载体选择的原则:微载体表面电荷密度要适中(交换量为1.52.8meq/g),微球在最低转速搅拌(或电磁搅拌)能良好地悬浮,微球大小200mm左右,颗粒大小均匀,球表光滑,在悬浮中不损伤细胞,要尽量少地吸收营养成分和血清,对细胞无毒性. 水化和消毒 微载体水化膨胀过程要用玻璃容器(最好能硅化),水化时,首先称一定量的微载体放入容器中,按每克加入无钙,镁PBS 50100ml,室温放置3小时以上,并不时用玻棒轻微搅动,然后再用新鲜的上述PBS洗一次(3050ml/g粉).如用型微载体,在水化作用时,表面因不易湿润而出现沉淀,因此当加入PBS后,要加数滴吐温80(23滴/100ml).消毒方法可采用高压蒸气消毒(121 25分钟),亦可在水化后用70%酒精浸泡消毒,再用无菌的PBS漂洗12次.但以前者更能确保无菌,消毒后将微载体放入培养基内,用搅棒搅动,使其呈悬浮状态,一般在250mL培养基中,微载体的浓度为3g/L,悬浮培养细胞时搅拌速度为5070r/min最好. 培养方法和操作程序培养容器:可采用悬浮培养所使用的发酵器,为防止微载体小球吸附到玻璃上,需要把玻璃发酵器内壁除以硅油.小球浓度:通常为25g/L,相当于80009000个小球/mL,所形成细胞贴附生长面积约810cm2/mL.细胞浓度:105/mL细胞接种培养,使每颗微载体小球表面能贴45个细胞,方可获得满意的培养结果,增加细胞接种量对提高细胞产量有利.培养条件:在发酵器中加入培养液,小球和细胞,一般说来和悬浮培养细胞系统的条件相同.(3)微载体细胞传代培养:在连续进行微载体细胞培养时,可以不必把细胞从微载体上分离下来,因加入新微载体后,细胞可从原先载体上移到新加入的微载体上,如果要做其它实验,需从载体上分离细胞进行传代,可用EDTA-胰蛋白酶消化1%胰酶5mL,1%EDTA2mL,PBS(pH7.2)93mL分离法进行分离,但比从玻璃瓶上分离细胞困难些,所以消化分离前,应选用不含血清的无钙,镁PBS洗涤培养物12次,同时使消化液的pH升高至pH7.88.0,并升高消化温度,延长消化时间,以利细胞消化分离.细胞脱离微载体后,可用自然沉降法,即在室温下静置510分钟,使微载体先自沉止底部,细胞大部分悬浮在上清中,然后取出上清离心后即可获得分离的细胞,如果需要分离程度较高时,需用孔径为100m的尼龙网或不锈钢网过滤后离心获得,就可达到分离较纯净细胞的目的.在许多情况下,如进行显微镜观察,切片染色,冷冻保存,可以使细胞脱离微载体,也可用带有细胞的微载体进行,用微载体培养哺乳动物细胞,能在短时间内得大量的活细胞,若条件合适,在一周内,可使细胞产量比原接种量增加数10倍,甚至几百倍,并可节省培养基.微载体培养即兼备了悬浮及单层两种培养方法的特点,培养罐并装有自动控制装置,能自动调节罐中的温度,pH,氧压等附件,可以随时取样观察,现已成功地培养了包括猴肾,狗肾,兔肾,牛肾,鸡胚等10多种原代贴壁细胞,还有WI-38,MRC-5,IMP90,F10W,2002,人包皮细胞FS-4,鼠胚,猩猩肝成纤维细胞等10余种二倍体细胞,以及BHK21,BHK13,Vero,CHO等10种传代贴壁细胞,并用这些细胞采用此法培养了多种病毒,并开展了病毒疫苗及干扰素的制备工艺的研究.(4)存在问题 微载体培养法在使用上尚需注意或解决下列问题:培养原代细胞时需要制成单个细胞,应避免细胞损伤,并除去细胞碎片,为此需改进胰酶消化细胞的方法,可采用胰酶灌注法,也可采用低温培育法解决.微载体所制备的疫苗和生化产品,含有异种血清,对人体能产生变态反应.即使通过离心洗涤,但仍有残余血清成分,因此最好是采用无血清培养基.微载体材料的毒性问题,虽经不断改进解决了许多问题,但仍有低毒性还需进一步研究改进.注意事项:细胞生长的开始阶段可适当增加细胞密度,减少培养体积,静止附着数小时以及降低搅拌速度,可提高细胞产量.如用指数生长期的细胞进行微载体培养所获细胞比用单层细胞者增加23倍,不同批号血清由于质量不同,对细胞影响大,需事先进行微载体培养预试验.培养时为了稳定pH,可加入适量Hepes,此外对人成纤维细胞,二倍体细胞可采用补充加入适量谷氨酰胺,胱氨酸,胆碱,肌醇和葡萄糖有利于提高细胞产量.总之在微载体细胞培养时,必须考虑到一些关键性参数,并且对每一种细胞都要选择其最适的培养条件,方能获得最佳效果.(5)培养实例Widal报告了用胎恒河猴肾细胞(Frhk-4)在交联葡聚糖载体上的培养方法,并对甲型肝炎病毒(HAV)在其中繁殖与常规繁殖作了比较.采用Cytodex3是新近发现的胶原包被的葡聚糖微载体,研究结果微载体细胞培养繁殖的HAV似乎是安全,经济和可行的方法,此培养方法有可能将来用于HAV疫苗的生产.目前也认为甲型肝炎病毒可用非洲绿猴肾细胞(AGMK),人胚二倍体细胞(HEE),FL羊膜传代细胞和Vero绿猴肾传代细胞系来进行繁殖(如图23-6,23-7).图23-6 一种容易换液的简单载体培养系统打开夹子(L1)用空气压力(在A处)将培养液从贮液库(R)中推入C瓶.收获细胞时,停止搅拌5分钟后,打开(L2),用空气压力(B)将培养液从C处吸入H瓶.S是取样点.图23-7 一种应用于高密度微载体培养细胞的灌注系统CU.培养容器;PE.贮液库;C.换液收获连接器;F.过滤器;G.气体混合器;L.水平控制器;M.取样装置;M.电磁棒;N.碱(NaOH)贮液库;OE.氧电极;PE.pH电级;P.泵;1.培养液贮库(连续的);2.培养液(由L控制2);3.碱贮库(用于pH计控制);R.流量计量器;SA.表面通气气体供应;SP.扩散气体供应;S.螺线管活塞.我国肖成祖等采用美国Whelton Biostir瓶罐进行微载体培养,培养前进行硅化瓶壁,载体用DEAE-Sephades G50加工制成的MC-1(按Lexine介绍的方法制作)作为载体,其粒径为75120m,阴离子交换量为1.4meq/g,处理方法为先用PBS(pH7.2pH 7.3)膨胀过液,灭菌后4保存.培养基为Eagle MEM,加5%小牛血清,25u/mL卡那霉素200u/mL庆大霉素,10mmol/L Hepes,用5%NaHCO3调pH至7.2.为了使微载体能在低转速下呈现悬浮状态,他们在瓶内的搅拌轴上加一带球形的头部侧棒,这样转速只要维持50r/min即可,所加入的微载体量为5g/L,载体先用培基洗一次,然后加入细胞和培养基,每天持续搅拌,培养过程中每天换液1/23/4,采用该培养系统和培养条件,作者既对BHK13,BHK21,CHO-K1三株细胞成功地进行了培养,又用该细胞制备了高效价的滤泡性口腔炎病毒(VSV),同时又成功地培养鼠L929细胞,并制备了高效价的IFN-.其细胞的生产和传代方法如下:微载体培养种子细胞将贴壁细胞用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后,用培养基调整接种细胞浓度为3105/mL.沿导流管加入含MC-1载体和培养基的Whclton Bioster瓶罐中37,50 r/min 搅拌30分钟静置30分钟(37)37,50 r/min 搅拌2分钟再静置24小时(37)(以利细胞贴附) 37,50 r/min 持续搅拌培养每天换液1/23/4量,并取样23mL,行染色计数连续培养三天细胞在微载体上生长良好,经计数可达1106/ml细胞浓度,扩增了三倍.基本达饱和密度,此时可以消化传代,进行扩大培养,也可以加入病毒,进行病毒或病毒疫苗生产或加干扰素诱生剂来生产干扰素(IFN-).微载体培养的细胞传代连续培养3天左右,细胞已基本在载体上铺满,已达饱和,此时为了扩大生产细胞,采用胰酶柠檬酸盐消化,并进行高速搅拌,可成功地将L929细胞,CHO-K1细胞从载体上解离,取样检查,计算解离率.即消化前先取样染色计数的细胞数为分母,消化后取细胞悬液,计数的细胞数为分子,两者进行比较即得解离率.结果解离率可达69%,当细胞扩增至34倍时,消化解离效果好.解离的细胞又可扩大再吸附,再进行微载体悬浮培养,细胞密度又可达1106/mL.经23次扩增可使细胞数量增加几十倍甚至上百倍,此法常用于生产病毒和病毒疫苗及细胞因子(IFN-等).(6)微载体的种类贴壁依赖的动物细胞在微载体表面上增殖,可分为贴壁,生长和扩展成单层三个阶段.细胞能否贴在微载体表面上,一是取决于细胞与微载体接触的机率;二是取决于细胞与微载体的相融性,这又是与基质表面的化学一物理性质相关.欲提高细胞与微载体的接触机率,理论上可以用提高搅拌桨转速以提高两者的碰撞频率来实现.但实际上,对动物细胞来讲,这种办法是行不通的,因为动物细胞是一脆弱的细胞,经受不起高的剪切力,否则将招致细胞损伤.另一方面,即使在高转速下,细胞与微载体的接触机率相应地提高了,但也缩短了细胞贴壁的时间,细胞来不及贴壁,就被湍流的流体带走了.因此,一般操作方式,采用低的搅拌桨转速,时搅时停,以使微载体能悬浮在培养基中为度,当停止搅拌时,整个系统是处在静止状态,利用细胞和微载体泳动相互接近,然后细胞贴在微载体表面上,这就需要较长的贴壁时间,也是造成动物细胞培养周期长的原因之一.细胞能否迅速贴在微载体表面上,还与微载体表面的物理-化学性质有关.一切脊椎动物细胞,在生理pH值下,表面带有分布不均匀的负电荷.似乎微载体表面要带正电荷,方能加快细胞贴壁速度,但实际情况不完全如此.因为控制细胞贴壁速度的基本因素,是微载体表面的电荷密度,而不是表面极性.此外,微载体表面还必须是亲水性.如微载体表面带的是正电荷,则由于静电吸附作用,使细胞容易贴在微载体表面上.但如电荷密度过大,所得的结果相反;如微载体表面带的是负电荷,则由静电相斥作用,使细胞贴壁困难.但如培养基中溶有或微载体表面上吸附着二价阳离子作媒介或蛋白质作桥梁,带负电荷的细胞也能贴在带负电荷的微载体表面上.最新研究结果表明,促使细胞贴壁的蛋白质分子,是冷析球蛋白(cold insoluble globulin)或纤粘素(Febronectin),两者均属于糖蛋白的一种蛋白质,都是血清中含有的成分.某些动物细胞,如人的成纤维细胞,能合成大量纤粘素,在无血清的情况下,也能贴壁.相反,某些细胞,如许多细胞系或转化细胞,合成这种糖蛋白的量很少,只有在培养基中外加糖蛋白,才能促使细胞迅速贴壁.在这种情况下,可以在培养基中补加血清,来提高糖蛋白含量.所以,无论微载体表面是带正电荷还是带负电荷,表面都可涂一层能吸附细胞的物质,如冷析球蛋白或纤粘素,用来加快细胞贴壁速度.Maroundas指出冷析球蛋白和纤粘素,都是微载体和细胞间架桥的蛋白质.二价阳离子所起的作用,是作为细胞与糖蛋白结合的媒介.细胞是通过二价阳离子结合到糖蛋白上.由以上所述,细胞能通过血清中糖蛋白的架合作用,贴在带正负电荷微载体的表面上.如微载体带的是正电荷,还可通过附加的静电吸引力,使贴壁速度加快.因此,若在接种细胞株之前,预先用有血清的培养基培育微载体,能加快细胞的贴壁速度.细胞在微载体表面上生长速度的快慢,除与细胞型和微载体基质的化学-物理性质有关外,还与细胞所处的营养条件和环境条件有关,如所处的条件最优,细胞生长速度快,反之,生长速度慢.所以,在动物细胞培养过程中,营养条件和环境条件(pH,溶氧,温度)都必须严格控制.培养基流加(feed-batch)系统,不如灌注(perfusion)系统,而灌注系统又不如恒化器(Chemostate)系统,其道理就在这里.细胞扩展行成单层的速度,除与以上各种因素有关外,还与微载体的表面情况有关.表面如是光滑,扩展成单层的速度快,表面如是多孔性,扩展成单层的速度就慢. 交联葡聚糖作基质的微载体1)DEAE-Sephadex A50环氧氯丙烷交联的珠状葡聚糖Sephadex G50表面,接上DEAE(di-ethy1 amin0 ethy1 chloride)即是DEAE-Sephadex A50,是Pharmacia公司商品.Van Wezel首先使用这种微载体贴壁培养了动物细胞,并取得了初步成功.在试验中Van Wezel也发现,这种微载体使用浓度如培养基超过1g/L,对细胞贴壁生长产生了毒性效应,具体表现在有50%-75%原始接种细胞损失掉了,并延缓了细胞贴壁时间.如浓度超过2g/L培养细胞的损失量更大,同时细胞生长也受到了抑制.Horng等人认为其毒性效应可能是微载体吸附培养基中生长因子和关键营养物质造成的.为了降低微载体毒性,已使用了各种方法,其中有:用血清,火棉胶或羧甲基纤维素预处理;提高接种的细胞量:或加旧培养基于细胞生长培养基中等等.采用这些方法,虽能缓解微载体的毒性,但改进不大,1977年Levine等人,通过减少接在Sephadex G50上DEAE的量(即减少正电荷量),来降低微载体的毒性就是根据这一概念.他们合成了阴离子交换量为2ml/g 的微载体,命名为MIT-微载体.这种微载体使用浓度可达5g/L培养基,没有发现对生长有毒性效应和延缓细胞贴壁的现象.Pharmacia公司也合成了阴离子交换量为1.5ml/mg的微载体,即商品名Cytodex 1.从以上情况,作为培养贴壁依赖细胞的微载体DEAE-Sephades A50 已被淘汰了.2)Cytodex 1微载体合成,是将带正电荷基团的DEAE氨解交联到葡聚糖的羟基上形成串联基团,其结构为交联葡聚糖.CH2CH3OCH2CH2NHC1CH2CH3这种微载体不同于其他微载体之处,在于微载体整体中都有电荷基团.如在合成Cytodex 1时,通过控制反应条件,可使带正电荷基团的量减少到15%左右.这一带正电荷基团的量,既能提高基团的稳定性和均匀度,也能降低基团从微载体上丢失的可能性.Cytodex 1 是当前用途最广的一种微载体,能适应培养的细胞类型不下60余种.3)Cytodex 2 微载体合成,是用带正电荷基团的N1,N2,N3-三甲基-2-羟基-胺基-丙烷(N1,N2,N3-trimethy1-2-hydroxy1 amino propy1)CH3OCH2CH(OH)CH2N CH3CH3由于是用季胺取代,故不会形成串联基团.带正电荷季胺基团,在微载体基质上分布均匀,结合牢固,在细胞培养条件下非常稳定,控制细胞贴壁速度是带正电荷的表面层.Cytodex 2所带的正电荷密度,远低于Cytodex 1,基本上不吸收培养基中成分,细胞代谢产物和细胞生化制品.这种微载体特别适用于生产病毒和用原代细胞或成纤维二倍体细胞生产生化制品.4)Cytodex 3微载体合成,是在交联葡聚糖表面上化学偶合一层变性胶原,偶合量为60g/cm2.Cytodex 3常被选用作体外贴壁培养困难的细胞的微载体.特别是对上皮形态细胞的贴壁培养,更有其独特的优点.其他细胞如肝细胞,成纤维细胞,软骨细胞,成肌细胞等,也用这种微载体进行过常规培养,Cytodex 3有很大优点,是用各种水解蛋白酶特别是胶原酶很容易消化细胞-微载体,把细胞从载体上剥脱下来,活细胞收获量相当高.多糖类作基质的微载体甲壳质(ZJ Chitin).虾皮蟹壳等废弃物,经酸碱处理,脱去其中石灰质和蛋白质,即得到甲壳质.将溶于有机溶剂中的甲壳质溶液分散到水,甲醇,乙醇等凝固液中,甲壳质即聚结成微珠.微粒大小,由分散口大小来调节.甲壳质的化学结构,N-乙酰基-D-氨基葡糖,以-4化学键直接联接的链状多糖,有多种用途.甲壳质微珠,除用作气,液相色谱柱载体外,预期也是贴壁培养动物细胞的优良载体,但研究不多. 碳水化合物作基质的微载体DEAE-纤维素微载体(DE-52,DE-53)英国Whatman生产的微圆柱体DEAE-纤维素(DE-52,DE-53),原先主要用作液相色谱柱载体,后经Reuveny研究,结果表明这种载体也能用作增殖多种贴壁依赖的细胞和生产生物制品.这类微载体是阴离子交换型,具有以下的独特性质:1)圆柱形,有较大的表面积/体积之比.2)与珠状叔胺衍生的微载体相比,它的表面积/体积之比小,故吸附培养基中成分相对地也较少.3)与珠状叔胺衍生的微载体相比,细胞贴壁和扩展速率快.4)比其他商品微载体价廉.确立细胞系细胞,在DE-52,DE-53微载体上是单层生长.当细胞完全覆盖微载体表面时,细胞能彼此吸附形成细胞桥,这一现象在DE-52微载体上特别明显(因离子交换量低),单层培养中,细胞能生长成圆形趋势.(例如Aedes Aegypi细胞系).人腺癌细胞系,在DEAE-纤维素微载体生长成细胞-微载体聚团,这些细胞都难以在珠状微载体上生长.原代细胞(CEF,鼠神经培养,鼠肌细胞)在DEAE-纤维素微载体上也能生长成细胞一微载体聚团,细胞重叠成若干层,聚团中心细胞所需营养物,由培养基流过载体微孔来提供,这是多孔性微载体在高密度细胞培养中的一大优点.在这类微载体上培养CEF细胞和病毒,能得到较高产率,但CEF只在DE-53微载体上生长,说明微载体的离子交换量,对某些细胞生长,有很大影响.培养神经细胞和肌肉细胞都能获得较高产率的成熟细胞,但来自二倍体细胞株,在这类微载体上难以生长.HeLa和Namalwa细胞在DEAE-纤维素载体上都能迅速生长.用纤维素作基质合成的微载体:可以根据需要作成圆柱形,珠形和纤维形,它对贴壁依赖的细胞生长有特殊功能.例如为了降低DEAE-Sephadex A50高正电荷的毒性效应,有时也可用火棉胶涂抹载体表面.纤维素微载体基础原料来源容易,合成程序不复杂,培养的细胞类型范围广,是一种很有价值,值得开发的微载体.2.6.4 蛋白质作基质的微载体明胶微载体,用明胶水溶液与疏水性有机液体如矿物油,明胶混合即聚结成微珠,继用戊二醛交联,最后用NaBH4还原,即得到淡黄色明胶微载体.这种微载体,具有优良的表面性质和光学性质,比重略大于水,基质是非刚性,无毒,能与多种细胞自然配位结合.特别是培养上皮形态细胞,如用其他基质微载体,收获细胞非常困