珠江和长江水系赤眼鳟D-loop基因序列多态性研究（科技创新）

丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品珠江和长江水系赤眼鳟D-loop基因序列多态性研究 陈彦珍 肖潇 唐张盛 杨婷 曾雪辉 杨慧荣* （1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510,6422.农业部渔业生态环境重点开放实验室，广东 广州 510300）摘 要：利用PCR技术扩增得到珠江和长江水系共29个赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）个体线粒体DNA D-loop基因片段，并测定其序列。对D-loop 基因序列进行分析，共检测到49个突变位点，其中，转换位点27个，颠换位点8个，插入/缺失位点14个；AT的含量（67.5）明显高于CG的含量（32.5）；五群体间的遗传变异率在0到0.603之间。在分子系统树上，长江水系14个个体单独聚成一支，珠江水系15个个体混杂在一起。可见：长江水系宜昌、武汉江段，珠江水系梧州、肇庆和三水江段赤眼鳟的种质资源较为混杂，遗传多样性较差，但珠江和长江两大水系已经出现了明显的遗传变异。分析其原因，同一水系内种质资源较为混杂，主要有以下两点：一、水体严重污染，赤眼鳟洄游迁徙造成的基因交流；二、赤眼鳟鱼苗的人工放流或逃逸造成的基因交流。而不同水系已经出现的明显的遗传变异主要是珠江和长江的地理隔离导致的生殖隔离。关键词：赤眼鳟 线粒体DNA D-loop 多态性 珠江 长江中图分类号： 文献标识码：A文章编号：Study on Polymorphism of D-loop Gene Sequence of Squaliobarbuscurriculus from Three Different Water AreasCHEN Yanzhen1 XIAO Xiao1 TANG Zhangsheng1 YANG Ting1 ZENG Xuehui1 YANG Hui-rong1* (1. Animal science College, South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China2. Key Laboratory of Fishery Ecology Environment, Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China) Abstract: 15 individuals mitochondrial D-loop gene segments of Squaliobarbus curriculus from Wuzhou, Zhaoqing and Sanshui (the number: WZ, ZQ and SS) in Pearl River,*通讯作者简介：杨慧荣 （1977-），女，湖北汉川人，讲师，在职博士，研究方向：鱼类生理与分子生物学。电话E-mail：were amplified with PCR technique, and sequenced. Analyse of the fifteen 679bp D-loop DNA sequences showed that there were 49 mutation sites in all, including 27 transitionsal sites, 8 transversional sites and 14 insert/lacuna sites. And the content of A+T (67.5%) was much more than the content of C+G (32.5%). The sequence diversity among the three populations ranged from 0 to 0.603%. According to the molecular phylogenetic tree constructed by NJ method on D-loop sequences, the individual WZ6 assembled one branch obviously, while the rest 14 ones immingled each other. That result did not match the distance of the three water area in geography. That was attributed to the exchang of genes, in that 2 factors might result as follows: First, migration of S. curriculus due to pollution of Pearl River; Second, being introduced artificially into natural water area and escaping for young fish of S. curriculus. And the obvious hereditary variation have appeared in different waters is mainly the sexual isolation caused by the geographical isolation between the Yangtze river and the Pearl river.Key Words: Squaliobarbus curriculus Mitochondrial DNA D-loop Polymorphism Yangtze River Zhujiang River赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）属鲤科（Cyprinidae），雅罗鱼亚科(Leuciscinae)，赤眼鳟属(Squaliobarbus)，俗称红眼棒、野草鱼、参鱼，在我国众多淡水水系及内陆水体中均有分布。赤眼鳟因其肉质细嫩，味道鲜美，具有抗病力强，食性杂，生长较快等特点，成为我国重要的经济鱼类之一。但是由于长期以来对渔业资源的不合理利用，特别是近年来水环境遭受严重污染，导致野生赤眼鳟资源衰竭，种质严重退化。鱼类线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，以mtDNA作为分子标记，已成为鱼类群体结构与系统演化关系研究的重要工具；而在mtDNA上，位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间的D控制区（D-loop）是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域1，一般用它来进行种内群体间的系统进化分析2。Lee等3专门探讨了硬骨鱼类D-loop的结构和进化方式，他们发现：即使在亲缘关系很近的物种间，也存在高度的长度变异。葛陇利等4对2个群体共40尾斑点叉尾鮰mtDNA的1256bp片段进行研究，共检测到核苷酸多态位点13个，且全部出现在长度为885bp 的D-loop控制区。可见D-loop区是线粒体基因组中进化最快的部分，建议可以用来分析鱼类的种内遗传多态性水平。 国内关于赤眼鳟的研究很少，仅有对其资源状况、生物学、养殖和人工繁殖的报道5，国外也只见对其生长和生活史的研究6，本研究开展的赤眼鳟群体的mtDNA D-loop基因片段多态性分析，旨在了解赤眼鳟群体的多样性状况，查明该鱼类的遗传背景和种质资源的家底，对于赤眼鳟的产业化养殖有着重要意义，为该物种多样性的保护和经济性状的改良工作提供必要的遗传背景资料和数据支持。1 材料与方法1.1 材料赤眼鳟样品于2008年6月分别采自长江水系的宜昌江段和武汉江段（编分别为YC、WH）和珠江水系的梧州、三水、新丰江段（编号分别为WZ、SS、XF），共计60个个体，活体运回实验室后取背部肌肉并置于超低温冰箱，取样后的赤眼鳟用福尔马林固定保存。1.2 方法1.2.1 基因的提取与扩增基因组DNA的提取参考分子克隆实验指南8的方法略加改进。PCR反应在Biometra PCR仪上进行。D-loop引物由英俊生物技术有限公司合成，序列如下： DL1：5-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3， DH2：5-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3。反应总体积50uL，其中10Taq Buffer 5uL，Taq Polymerase 0.5uL (5U.uL-1)，dNTPs（2.5mmol.L-1 each）4uL，Mg2+(25mmol.L-1)2.5uL，引物1和2（10umol.L-1）各2uL，模板DNA 50ng，无离子超纯水35.5uL。扩增条件为：94预变性2min后，再进行35个循环，每一循环包括：9445s，5845s，721min；最后72延伸7min。每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。扩增产物经1.5%TBE琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外灯光下检测、拍照。1.2.2 测序与数据分析产物纯化和序列测定由上海基康公司（Genecore Co.）完成。DAMBE软件统计单倍型和作图看转换、颠换是否达饱和；采用MEGA 4.1软件中的“statistics”统计DNA序列的碱基组成和转换/颠换数；“distance”统计各个个体间的遗传变异率，用NJ法进行聚类分析，构建聚类关系树。2 结果2.1 D-loop基因序列的信息及变异情况由NAMBE统计可知：在29各个体中共检测出24个单倍型。由转换、颠换对遗传距离图（图1）可知：转换和颠换数没有达到平台效应，即没有达到饱和状态，说明供统计分析的数据准确可靠。由MEGA4.1统计可知：三个不同水域赤眼鳟D-loop基因序列的长度为589bp，共发现32个变异位点。其中，插入/缺失位点2个；颠换位点3个，转换位点27个，转换明显高于颠换，平均的转换发生频率是颠换的3.478。简约信息位点数是14。由MEGA 4.1中“statistic”命令统计29个个体D-loop基因片段中A、T、C、G碱基平均含量分别为33.9%，34.7%，17.7%，13.8%，其中，A+T的含量（68.5%）明显高于C+G的含量（31.5%）。 图1 转换、颠换对遗传距离图（S表示转换，V表示颠换）Fig. 1 The graph of transition and transversion versus divergence （S means transition，V means transversion）2.2 不同水域赤眼鳟群体D-loop基因序列的多样性由MEGA 4.1中“distance”命令统计出两水系五个水域赤眼鳟不同个体间的遗传变异率及转换/颠换数（表1），由表可见：五个不同群体间的遗传变异率在0-6.03%之间，而赤眼鳟不同个体与青鱼的遗传变异率在17.86%-19.75%之间。不同个体D-loop基因序列间，发生转换的位点数为0-27,颠换的位点数为0-8，转换数明显高于颠换数，总平均转换颠换比为3.478；且赤眼鳟与草鱼之间的转换和颠换数均大于赤眼鳟群体内的转换和颠换数。五个不同水域赤眼鳟（SS、XF、WZ、YC、WH）群体内的遗传距离分别是0.0098、0.0117、0.0109、0.0053、0.0095,群体间的遗传距离分别是0.0115、0.0141和0.0118，总平均遗传距离为0.0292（不含外群）（表2），可见群体间没有出现明显的遗传分化。表1 三个水域赤眼鳟个体间D-loop 基因序列差异百分比（对角线以下）和转换/颠换数（对角线以上） Tab. 1 Percent of pairwise sequence variations (lower triangle) and ratios of transition/transversion (upper triangle) of the D-loop gene for S. curriculus from three different water areas123456789101112131415161718192021222324252627282930SS1000001706080806080909080811332142242242242042142142042072062051952362255038SS40.000000706080806080909080811332142242242242042142142042072062051952362255038SS50.000.0000706080806080909080811332142242242242042142142042072062051952362255038WZ50.000.000.00706080806080909080811332142242242242042142142042072062051952362255038SS31.235070705070808070711132542642642642442542542442472462452352762655138XF31.051.051.051.050.8740402040505040411032242342342342142242242142171962152052462355038WZ31.401.401.401.401.230.70202040505040611232242342342342142242242142172162152052462355338WZ41.401.401.401.401.230.700.352040505040611232242342342342142242242142172162152052462355138XF51.051.051.051.050.870.350.350.3520303020411032042142142141942042041941971961951852262155138WZ11.401.401.401.401.230.700.700.700.3510100041831841941941941741841841741771761751652061955038SS31.581.581.581.581.400.870.870.870.520.17001051931942042042041841941941841871861851752162055138XF11.581.581.581.581.400.870.870.870.520.170.001051931942042042041841941941841871861851752162055138XF21.401.401.401.401.230.700.700.700.350.000.170.1741831841941941941741841841741771761751652061955038WZ21.591.591.591.591.410.880.881.051.050.88842052152152151952052051951981971961862272165239XF42.852.852.852.852.492.312.672.672.311.952.131851951951951751851651551581571761662071964937YC14.514.514.514.515.264.704.704.704.333.964.524.15101010100040303342211152314940WH64.694.694.694.695.454.884.884.884.514.144.324.324.144.704.330.172020201050404352312162415040YC24.704.704.704.705.454.884.884.884.514.144.334.334.144.704.330.170.3500201050404352312162414940YC44.704.704.704.705.454.884.884.884.514.144.334.334.144.704.330.170.350.00201050404352312162414940WH14.324.324.324.325.074.514.514.514.143.773.963.963.774.333.960.170.350.350.351030202332110142214840YC74.514.514.514.515.264.704.704.704.333.964.524.150.0070.1740303342211152314940WH34.514.514.514.515.264.704.704.704.333.964.523.780.700.870.870.870.520.70101322413172515140YC64.324.324.324.325.074.514.514.514.143.773.953.953.774.333.590.520.700.700.700.350.520.170312312162415040WH24.914.914.914.915.604.724.354.534.534.354.914.171.030.881.060.700.5315342465445043YC34.714.714.714.715.464.524.904.904.534.154.344.344.154.723.971.030.881.050.700.531.06413172535046WH54.524.524.524.525.274.704.704.704.333.964.524.150.520.700.700.700.350.520.880.701.240.881051324941YC54.334.334.334.335.084.524.524.524.153.783.963.963.784.343.970.350.520.520.520.170.350.700.521.060.700.1741224841WH45.275.275.275.276.035.465.465.465.094.714.904.904.715.284.911.231.411.411.411.051.231.591.411.951.591.050.88215042WH74.894.894.894.895.645.085.085.084.704.334.524.524.334.904.520.700.880.880.880.520.701.050.881.411.410.880.700.525041M.18.3618.3618.3618.3618.6018.3619.0718.5918.6018.3618.6018.6018.3619.1217.8618.6718.9118.6718.6718.4418.6719.1518.9119.7519.4718.9518.7119.4619.18表2 三个水域赤眼鳟群体内 、群体间以及总平均遗传距离Tab.2 The within (on triangle)and between (lower triangle) group average genetic distances, overall mean distance（the last line） from three different water areas of S. curriculus遗传距离Genetic DistancesSS群体SS GroupWZ群体WZ GroupXF群体GroupYC群体GroupWH群体GroupSS群体SS Group0.0098WZ群体WZ Group0.01130.0109XF群体Group0.01380.01100.0117YC群体Group0.04620.04510.04250.0053WH群体Group0.04810.04700.04450.00760.0095总平均遗传距离Overall Mean Distance0.0292（不含外群）2.3 分子系统树以青鱼（Mylopharyngodon piceus）D-loop基因序列为外源种群，用MEGA4.1中的“NJ”法构建分子系统树，其拓扑结构见图1。Bootstrap 1000给出各支的置信度，最高为96，最低为22。三个水域赤眼鳟不同个体间的系统树主要可以分为两支：XF4号个体单独为一支，其余14个个体混杂在一起形成另外一支。图1 三个不同水域赤眼鳟D-loop 基因序列的UPGMA分子系统树(数值表示1000次重复抽样的百分比)Fig. 2 The molecular phylogenetic tree of S. curriculus from three different water areas by NJ methhod (numbers indicate bootstrap values of 1000 replicates)图2 三个不同水域赤眼鳟D-loop 基因序列的UPGMA分子系统树(数值表示1000次重复抽样的百分比)Fig. 2 The molecular phylogenetic tree of S. curriculus from three different water areas by UPGMA methhod (numbers indicate bootstrap values of 1000 replicates)图3 三个不同水域赤眼鳟D-loop 基因序列的MP分子系统树(数值表示1000次重复抽样的百分比)Fig. 2 The molecular phylogenetic tree of S. curriculus from three different water areas by MP methhod (numbers indicate bootstrap values of 1000 replicates)2.4 讨论在所研究的不同水域赤眼鳟个体D-loop基因片段的679bp长度序列中检测出了23个变异位点，其中既有插入/缺失位点，也有转换、颠换位点，再一次验证了D-loop基因序列的高进化速率。在Cyt b中很少会发现插入/缺失的位点9，主要是由于Cyt b用于编码蛋白质，如有插入/缺失的发生很容易就会被淘汰；而D-loop片段的基因主要与线粒体基因的调控有关，不受蛋白功能上的需要和三联体密码的限制，所以插入/缺失突变后比较容易被保留。而序列中的转换数一般情况下都大于颠换数9，其原因仍不清楚，需要进一步研究。从遗传变异率来看，三个水域赤眼鳟不同个体间的变化范围从0.2%到3.1%。研究表明，淡水鱼同种个体间线粒体遗传变异的峰值水平是10%10。本研究中的遗传变异范围在这个峰值之内，且明显小于赤眼鳟与不同种（青鱼）之间的遗传变异率（10.7%11.8%），所以本研究中不同水域间赤眼鳟群体仍没有产生新的亚种或种的分化的可能，为2.1%3.1%，与梧州同肇庆和三水地理隔离距离较远相符之外，其他梧州个体与另外两地个体之间的差异都不大，最大变异率为1.8%，最小的为0，几乎是混杂在一起。从分子系统树上来看，长江水系14个个体单独聚成一支，珠江水系15个个体混杂在一起。可见：长江水系宜昌、武汉江段，珠江水系梧州、肇庆和三水江段赤眼鳟的种质资源较为混杂，遗传多样性较差，但珠江和长江两大水系已经出现了明显的遗传变异。就算是bootstrap1000得到置信度最高（100和98）的分支，也是由长江YC、WH群体以及珠江WZ、ZQ和SS群体混杂而成。从地理位置上看，虽然梧州江段和肇庆江段同属西江水系，三水江段属北江水系，但是北江在三水思贤窖处以水道与西江交汇，连为一体，使得实际上肇庆到三水的水路距离只有肇庆到梧州的1/4。因此，从地理距离来看，肇庆和三水江段赤眼鳟的亲缘关系较近，且都与梧州江段赤眼鳟有较远的亲缘关系。既是说，在分子树上，肇庆、三水和梧州江段的赤眼鳟本应该各聚成一支，或是肇庆与三水个体聚成一支后再与梧州个体聚成一支。然而，在本研究结果中，梧州、肇庆和三水三水域赤眼鳟的种质资源较为混杂，遗传多样性较差，分析其原因，主要有以下两点：一、 水体污染严重，赤眼鳟洄游迁徙造成的基因交流珠江三角洲地区江段的水文条件复杂，使得污染物进入珠江三角洲网河区后，在河流中来回振荡，有的能在河流中停留长达一周以上11。尤其是在洪水期，珠江三角洲水质污染更为严重，其中以广州片水道的污染最严重，其次是西江片水道，北江片水道稍好。污染类型为有机物污染，总磷超标最为严重，超标率达71%12。而同为西江片的水质，位于上游的广西段，经济欠发达，污染物总量相对较小，下游广东段水质明显变差13。三个采样点江段中，梧州段位于广西与广东交界的广西境内，肇庆段位于西江下游广东段，三水段位于北江。赤眼鳟生活于水体的中上层，因而对水体的有机物污染比较敏感；同时赤眼鳟属于半洄游性鱼类，能在淡水水体之间移栖或在江河上下游之间运动。有报道指出，鱼类的洄游是动物最大限度地提高种群存活、摄食、繁殖和避开不良环境的能力，是鱼类种群获得延续、扩散和增长的重要行为特征14。因此，当肇庆江段污染超过当地赤眼鳟的耐受限度时，该群体中的个别或一部分个体便可能游到周边水域，如向西江上游或沿三水思贤窖处水道洄游迁徙，在迁徙的过程中，有可能与当地的赤眼鳟进行繁殖，从而产生基因交流。同时，如果迁入水域的水质不能满足鱼体的生长需要或产生恶化，原赤眼鳟的亲本或是其后代便有可能继续迁徙，从而造成了更大范围的基因交流。当然，这个过程是比较漫长的，需要十几年到几十年的时间，在这个时期内，也不能排除早期梧州江段或三水江段的赤眼鳟向肇庆江段洄游迁徙从而造成基因交流，种质混杂的可能性。二、 赤眼鳟鱼苗的放流和逃逸造成的基因交流赤眼鳟是珠江流域重要的半洄游性鱼类，但珠江水系的水坝工程、航道整治、堤防工程等都严重影响了包括赤眼鳟在内的洄游、半洄游性鱼类的存和繁衍，使得其野生生物量大大下降。20世纪80年代特别是90年代以来，流域内部部分江段开始放流人工鱼苗。2001年，珠江流域开始放流包括中华鲟和四大家鱼在内的多种人工鱼苗，包括经济价值很高的赤眼鳟人工鱼苗15。对于放流的人工鱼苗，由于数量巨大，多数是从各地苗种场购买获得，从而导致了鱼苗的遗传背景比较混杂，最终造成了外来种与本水域土著种的基因交流。因此，人工鱼苗的放流，也很可能是造成本研究结果中赤眼鳟的种质资源混杂，遗传多样性下降的重要原因。在次，作为经济价值较高的鱼类，对赤眼鳟鱼苗的输出及引入以获得经济利用的行为在各地均有发生，近年来，人工养殖赤眼鳟已蓬勃发展，其中，有池塘精养，也有河流、水库、湖泊放养。但是由于管理不善，使得养殖鱼体逃逸到其他水域并以土著种进行繁殖，便有可能造成种质资源的混杂。而不同水系已经出现的明显的遗传变异主要是珠江和长江的地理隔离导致的生殖隔离。不同水系的赤眼鳟群体其繁殖季节有明显的区别，长江群体为5月初至6月初，珠江群体为3月中旬至5月初，从生殖习性来看，他们都有各自的繁殖季节和产卵区域；从地理位置和气候来看，南北气候相差较大，长江属于属温带季风气候，珠江属热带海洋性气候，它们在地理条件、生态环境和繁殖习性上的较大差异直接导致了地理隔离和生殖隔离，所以在不同水系形成遗传性能上互有差异的孟德尔繁育群体，两者明显属于相互独立的不同地理群体。参考文献1 崔树彬,王现方,邓家泉. 试论珠江水系的河流生态问题及对