半胱氨酸蛋白酶抑制剂 大菱鲆 细菌感染论文.doc

半胱氨酸蛋白酶抑制剂论文：大菱鲆免疫相关基因cystatin B的克隆表达和功能分析【中文摘要】半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)是一类广泛分布的半胱氨酸蛋白酶抑制因子,在哺乳动物的正常生理状态和病理过程中发挥着重要作用。但在鱼类中对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究却很少。本研究发现并鉴定分析了大菱鲆(Scophthalmus maximus)半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(SmCytB)。SmCytB的开放阅读框长度为300bp,编码99个氨基酸残基,与多种鱼类Cystatins B的序列具有较高的同源性,并具有Cystatins B的保守性功能活性位点。正常生理条件下,SmCytB在肌肉、脑、心脏,肝脏的表达量较高,而在脾脏、血液、腮、肾中表达量相对较低;细菌侵染时,肾、脾、肝、脑中SmCytB表达量显著上升,而在肌肉、心脏中表达量水平变化不大。体外原核表达重组的SmCytB具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。SmCytB在大菱鲆头肾巨噬细胞过量表达能显著增强巨噬细胞杀菌能力,且这种增强机制不依赖于一氧化氮途径。综上所述,SmCytB与大菱鲆的抵抗细菌感染的免疫防御密切相关。【英文摘要】Cystatins form a large family of cysteine protease inhibitors found in a wide arrange of organisms. Studies have indicated that mammalian cystatins play important roles under both physiological and pathological conditions. However, much less is known about fish cystatins. In this report, we described the identification and analysis of a cystatin B homologue, SmCytB, from turbot Scophthalmus maximus. The open reading frame of SmCytB is 300 bp, which encodes a 99-residue protein that shares high levels of seq.【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂 大菱鲆 细菌感染【英文关键词】Cystatin B Scophthalmus maximus Bacterial infection【目录】大菱鲆免疫相关基因cystatin B的克隆表达和功能分析摘要4-5Abstract5第一章 前言8-141.1 大菱鲆简介8-91.2 鱼类免疫系统9-101.3 半胱氨酸蛋白酶10-111.4 半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族11-131.4.1 概述111.4.2 分类11-121.4.3 Cystatin 结构域121.4.4 Cystatin 的功能12-131.5 本研究的目的和意义13-14第二章 Cystatin B全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析14-252.1 材料和方法14-212.1.1 实验材料14-152.1.2 cDNA文库构建前实验动物的处理152.1.3 大菱鲆cDNA文库的构建152.1.4 大菱鲆cDNA文库的筛选与Cystatin B基因部分序列的获得15-162.1.5 大菱鲆 Cystatin B 全长 cDNA 的获得16-202.1.6 Cystatin B序列的生物信息学分析20-212.2 结果与讨论21-252.2.1 Cystatin B 全长 cDNA 的获得212.2.2 SmCytB的序列分析21-222.2.3 SmCytB的同源性对比和活性位点分析22-242.2.4 SmCytB蛋白同源物的进化树分析24-25第三章 rSmCytB 的克隆、表达纯化和功能分析25-363.1 材料和方法25-333.1.1 实验材料253.1.2 SmCytB 基因的克隆25-283.1.3 SmCytB基因的序列鉴定28-303.1.4 重组蛋白 rSmCytB 的表达30-313.1.5 rSmCytB蛋白的纯化31-323.1.6 rSmCytB蛋白的抑制活性检测32-333.2 结果和讨论33-363.2.1 SmCytB的克隆333.2.2 rSmCytB表达和纯化33-343.2.3 rSmCytB的活性测定34-36第四章 大菱鲆半胱氨酸蛋白酶抑制剂SmCytB的功能研究36-504.1 材料和方法36-454.1.1 实验材料36-374.1.2 荧光定量实时PCR分析SmCytB在大菱鲆组织中的表达情况37-394.1.3 细菌刺激后SmCytB 在鱼体组织内表达量变化的分析研究39-404.1.4 大菱鲆巨噬细胞SmCytB过量表达40-434.1.5 SmCytB过量表达鉴定434.1.6 SmCytB过量表达对头肾巨噬细胞杀菌活性的影响43-444.1.7 SmCytB过量表达对头肾巨噬细胞NO产生的影响44-454.2 结果与讨论45-504.2.1 SmCytB在大菱鲆中的组织特异性分析454.2.2 细菌刺激后SmCytB在鱼体组织内表达量变化情况45-474.2.3 对转染子进行实时荧光定量PCR测定SmCytB的转录水平474.2.4 免疫印记法（western blot）测定SmCytB蛋白表达47-48