高尔基染色.doc

高尔基染色一. 实验原理 重铬酸钾与硝酸银发生反应，生成黑色的铬酸银沉淀，由于组织的嗜银性而沉积于神经元中。二. 药品、试剂、仪器 药品和试剂：水合氯醛、重铬酸钾、40 %甲醛、硝酸银、火胶棉、二甲苯、梯度酒精、树胶、明胶 仪器设备：输液器、染色缸、手术器械、Leica震荡切片机、毛笔三. 实验步骤1. 10 %水合氯醛以0.1 ml/10 g体重经腹腔麻醉小鼠。一般2-3 min 后出现麻醉效应。若个别小鼠麻醉效果不好，可少量追加麻药。2. 灌注与固定 用0.5 亚硝酸钠的生理盐水溶液 （现配现用）从小鼠左心室灌注，同时打开右心耳，至从右心耳流出的液体无血色（5-10 min），遂将灌注液换成l0 甲醛生理盐水溶液继续灌注进行固定。这一过程中前液使血管扩张，后液使组织充分固定。因此，在灌注固定液时，宁可多用固定液使之充分将前液置换。 3固定液灌注充分（约需200-300 ml）后，用血管钳夹住右心耳，静候12小时。4. 打开血管钳，用下列媒染液灌注，至流出液显浓厚桔红色，再夹住右心耳静待12小时，至此已完成灌注过程。媒染液配方；水合氯醛 50 g 重铬酸钾 50 g 蒸馏水 400 mI 待以上成分溶解后加40 %甲醛液100m1摇匀，最后加蒸馏水1000m1。5开颅取出所需组织。用刀片将组织冠状切为厚约5 mm 的小块，仍用媒染液浸泡，置暗处避光，室温3天。6换瓶用1.5硝酸银水溶液浸泡镀银，置暗处3(7)天。每日换新银液一次(换新的瓶子，用锡箔纸包好，不能用镊子，用长的棉签杆)，并及时摇动瓶，使镀银充分。 7用火棉胶包埋组织块 （1 min）后用Leica震荡切片机切为厚度为50m（100-150um,50um效果不太好）的切片。切片再浸于2（3.5%）重铬酸钾水溶液漂洗10 min。如果不长期储存，可以直接将组织放在载玻片，盖一个盖玻片，直接观察，但是必须当天做完，如果长期保存按下面操作进行。 8流水漂洗后贴片于预先涂有1 %明胶并烘干的载玻片上，沾干水分。9. 快速经酒精梯度脱水：70 % - 80 % - 90 % - 95 % - 95 %- 100 %-100 %，每次5 min，用漏斗回收酒精。10. 经二甲苯漂洗10 min，树胶封片，晾干。11、普通显微镜（1501），1000倍。 四. 评价指标、统计方法神经元及胶质细胞的胞体和突起均呈棕黑或黑色。此法的成功率较高。这类方法之所以经久不衰主要是因为1.所显示的细胞成分，色调浓重，易于分辨；2.未被染出的细胞无色，致背底清澈色调很淡，对比度极好；3.操作过程比较简单。下图是用806实验室的正置显微镜配备的照相机拍摄的照片。可以黑白或彩色照片输出。 统计方法: 在100倍油镜下对感兴趣区域的神经元的树突棘进行计数，以单位长度树突上的棘数量作为指标进行t-test (两组)或方差分析 （多组），以考察某因素对神经元的形态可塑性的影响。五. 注意事项1. 开胸时注意保持心脏的完整性。2. 灌流时最好将输液器针头置于主动脉中（从心尖垂直进针），要注意区别主动脉和上腔静脉。用动脉夹将针头连同心脏一道夹牢后进行灌注。下图为心的正面观。 3. 用0.5 %亚硝酸钠的生理盐水灌注时先快后慢，快时液体流动如线状。约需100 ml。4. 配制甲醛溶液和灌流都在通风橱中操作。5. 固定液灌注充分的标志为动物肢体僵硬。6. 配制媒染液时，重铬酸钾常温下较难溶，可于37 OC浴槽中搅拌配制。7硝酸银水溶液每次现配现用。用媒染液浸泡和镀银时用锡纸将瓶完全包住。8震荡切片时使用双蒸水。9. 在涂有1 %明胶的载玻片上贴片时经常出现脱片的现象，可尝试在载玻片上涂0.01 %多聚赖氨酸并烘干再用于贴片。防滑玻片制备：明胶硫酸铬钾