基于顺铂抗癌药物的合成及DNA键和性质的研究毕业论文.doc

共 32 页 第 0 页 装 订 线 基于顺铂抗癌药物的合成及基于顺铂抗癌药物的合成及 DNA 键合性质的键合性质的 研究研究 摘要摘要 癌症是严重威胁人类健康和生命的常见病和多发病 已经成为人类死亡的第二大病因 自 1967 年发现顺铂具有抗癌活性以来 经过 30 多年的发展 铂类金属抗癌药物的合成应用和研究得到了迅速的发展 与此同时 研究药物和 DNA 的相互作用是药物发现和药品研发过程中最重要的课题之一 G 四链体是富含鸟嘌 呤碱基的 DNA 通过氢键相互作用形成的四链螺旋结构 这种结构可以有效的抑制端粒酶的活性 它可以阻碍端 粒酶对端粒 DNA 引物的识别 使细胞正常凋亡 从而达到抗肿瘤的效果 近年来 以 G 四链体为靶点的抗癌 药物研究引起了人们的广泛注意 本文的工作重点是合成配合物 通过紫外滴定和荧光滴定手段研究已有钌配 合物对 G 四链体稳定性 DNA 对金属离子的特异性识别 关键词关键词 铂 II 配合物 G 四链体 DNA 钌 II 配合物 Application of Bjerrum Function in Determination of Stability Constants Abstract Cancer is a common and frequently occurring diseases seriously threatening human health and life which has become the second largest human death cause Since cisplatin was found having anti cancer activity in 1967 after 30 years of development the synthetic applications and research of metal anti cancer drugs of platinum obtained a rapid development At the same time the research of the reaction betwwen drugs and DNA is one of the most inportant issues in the process of discovery and development of drugs G quadruplex is rich in guanine bases of DNA which formed through the hydrogen bonding interaction of the formation of the four chain spiral structure This structure can inhibit the telomerase activity effectively hinder telomerase to telomere DNA primers recognition and make normal cell apoptosis so as to achieve antitumor purpose In recent years the G quadruplex target cancer drug research has attracted widespread attention This paper is focused on the synthesis of complexes using the ultraviolet titration and fluorescence titration method to study the stability of existing metal ruthenium complexes to G quadruplex and DNA s identification to the specificity of the metal ions Key words Pt II complexes G quadruplex DNA Ru II complexes 共 32 页 第 1 页 装 订 线 目录 1 引言 3 1 1 基于顺铂抗癌药物的研究意义 3 1 2 金属铂抗癌药物的发展 3 1 3 核酸的组成与结构 3 1 3 1 概述 1 3 2 DNA 结构 1 4 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系 1 4 1 G 四链体 1 4 2 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系 1 5 本文所作的工作 3 2 理论部分 4 2 1 DNA 与配合物作用的研究方法 4 2 2 各种生成函数法的测定原理 4 2 2 1 光谱学方法 4 2 2 2 流体力学方法 4 2 2 3 密度泛函计算与分子模拟 4 3 实验部分 5 3 1 引言 5 3 2 药品和仪器 5 3 2 1 实验试剂 5 3 2 2 实验仪器 5 3 3 配合物的合成及表征 5 3 2 1 配体的合成 3 2 2 铂配合物的合成 3 4 不同辅助配体的多吡啶配合物与 G 四链体 DNA 的相互作用的研究 3 4 1 缓冲溶液的配制 3 4 2 配合物与 DNA 浓度的确定 3 4 3 配合物与 G 四链体相互作用的紫外 可见光谱滴定 3 4 4 配合物与 G 四链体作用的荧光光谱滴定 4 结果和讨论 6 4 1 钌配合物与 G 四链体电子吸收光谱研究 7 4 2 钌配合物对端粒 G 四链体的选择识别研究 7 5 结论和展望 8 5 1 结论 8 5 2 展望 8 参考文献 9 谢辞 10 共 32 页 第 2 页 装 订 线 1 引言引言 1 1 金属抗癌药物的发展金属抗癌药物的发展 1965年Rosenberg偶然发现顺二氯二氨合铂 cis Pt NH3 2Cl2 又称顺铂 对大肠杆菌的分裂有 抑制作用 并于1969年首次报道了顺铂具有很强的抗癌活性 1975年顺铂成为第一个用于临床 的金属配合物抗癌药物 从此以后 金属药物及其抗肿瘤机理成为人们关注的研究热点 但是顺铂水溶性差 且仅能注射给药 缓解期短 并伴有严重的肾 胃肠道毒性 耳毒性及 神经毒性 长期使用会产生耐药性 为此 人们开始展开对其它铂系抗肿瘤药物的研究 但结 果并不理想 铂系抗肿瘤药物在临床使用上具有毒副作用大以及耐药性的问题 促使研究者积极寻找非 铂系抗肿瘤药物 目前非铂系金属抗肿瘤药物研究主要集中在钌 铑 锡 锗等金属配合物 特别是钌配合物 作为铂类配合物的对照物 钌配合物很早就被运用于抗肿瘤实验 与顺铂相 较 钌配合物毒性相对较小 在生物体内易于吸收 也易于代谢而且钌配合物有在肿瘤组织中 发生聚集的特点 能够与DNA 分子以共价键或者非共价键 静电结合 沟面结合和插入结合 方 式缔合 从上世纪八十年代以来 钌配合物作为抗肿瘤药物的研究已经成为药物化学 化学生物学 配位化学以及生物无机化学的热点研究领域之一 1 2 金属铂抗癌药物的发展金属铂抗癌药物的发展 自1967年美国密执安州立大学教授Rosenberg B 和Camp V 发现顺铂具有抗癌活性以来 经 过30多年的发展 铂类金属抗癌药物的合成应用和研究得到了迅速的发展 顺铂 卡铂的开发 成功和临床应用给癌症的治疗带来了一场新的革命 有数据表明 DNA链中许多相邻的碱基间两个氮原子距离为340 pm 而顺铂中两个氯原子 间的距离为330 pm 两者恰好匹配 形成的铂化DNA寿命较长且不易被细胞蛋白如高移动组 HMG 蛋白识别并修复 因而将破坏肿瘤细胞DNA的复制 抑制细胞分裂 最终杀死肿瘤细胞 现在 顺铂和其他铂化合物已显示出它与病毒 细菌 寄生菌作斗争的潜力 除此此外 铂化合物也有希望用来诊断一些疾病 自从顺铂的抗癌活性被发现以来 铂类抗癌药物的研究 和应用得到了迅猛的发展 如今 顺铂和卡铂已成为癌症化疗中不可缺少的药物 1995年 世 界卫生组织对世界上近百种抗癌药物进行评价 顺铂的疗效 市场等综合评价得分名列前茅 顺铂和卡铂所获得的成就极大地鼓舞了各国学者积极研究更好 更有效的铂类抗癌新药 目前铂类配合物的合成已历经三代 顺铂是第一代铂类抗癌药物 结构如图1 1所示 该药的使用局限性是它的耐药性及剂量 毒性人体器官尤其是对肾脏的损害较大 第二代铂类配合物 结构如图1 2所示 其中以卡铂 为代表 结构如图1 2所示 其水溶性优于顺铂 肾毒性低于顺铂 主要不良反应为骨髓抑制 第三代铂类代表化合物乐铂 结构如图1 3所示 乐铂全称是环丁烷乳酸盐二甲胺合铂 研究表明 该药的抗肿瘤效果与顺铂 卡铂的作用相当或者更好 毒性作用与卡铂相同 且与 顺铂无交叉耐药 共 32 页 第 3 页 装 订 线 图图1 1 第一代主要铂类抗癌药物的结构第一代主要铂类抗癌药物的结构 图图1 2 第二代主要铂类抗癌药物的结构第二代主要铂类抗癌药物的结构 图图1 3 第三代铂类抗癌药物结构第三代铂类抗癌药物结构 目前铂类配合物研究的方向是 寻找比顺铂和卡铂疗效更好 不良反应更小 药学特性得到 改善的化合物 扩大抗癌谱 开发与顺铂和卡铂无交叉耐药性的新型药物 1 3 核酸的组成与结构核酸的组成与结构 1 3 1 概述概述 构成生命物质的两类主要大分子是蛋白质和核酸 核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大 分子化合物 广泛存在于所有动物 植物细胞 微生物内 与蛋白质构成生命物质的两类主要 的大分子 生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白 核酸是生物体的重要组成物质 在蛋白 质的生物合成上占重要位置 与生物的生长 发育等正常生命活动以及癌变 突变等异常生命 活动中起决定性的作用 因此 核酸是现代生物化学 分子生物学和医学的重要基础之一 衰老和癌变是人类的两大医学难题 二者与端粒和端粒酶有密切关系 端粒是真核细胞染 色体末端富含鸟嘌呤的 DNA 重复序列及一些结合蛋白组成的特殊结构 端粒除了提供非转录 DNA 的缓冲物之外 还能保护染色体末端免于融合和退化 在染色体定位 复制 保护和控制 细胞生长及寿命方面具有重要作用 并与细胞凋亡 细胞转化和永生密切相关 在生理状况下 随着细胞分裂次数增加 端粒在复制分裂过程中将逐渐丢失碱基 从而使端粒渐进性缩短 当 共 32 页 第 4 页 装 订 线 端粒缩短至一定长度时细胞将进入生长停止衰老死亡阶段 即出现细胞的凋亡 研究发现 端 粒酶能保证端丽的正常复制 除了胚胎组织 生殖细胞和少数造血肝细胞中具有端粒酶火星外 绝大多数体细胞中无端粒酶活性 但是 85 以上的肿瘤细胞端粒酶表达呈阳性 因此 以抑制 端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究已成为一种新的药物作用靶点 而且极有希望成为最安 全 有效的治疗肿瘤的理想途径 核酸是生物体内的高分子化合物 单个核苷酸是由碱基 戊糖和磷酸三部分构成的 根据 所含戊糖的差异 核酸可分为脱氧核糖核酸 DNA 和核糖核酸 RNA 两大类 核苷酸中的 碱基分为嘌呤和嘧啶两类 DNA 主要由含腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的核 苷酸构成 RNA 主要由含腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 和尿嘧啶 U 的核苷酸构成 1 3 2 DNA 结构结构 DNA 之所以能含有生物物种的所有遗传信息 是因为其结构非常复杂 每个人体细胞的 DNA 约含有 100 亿个碱基 DNA 分子的结构 有以下三种 第一 DNA 的一级结构 四种脱氧核糖核酸按照一定的顺序 通过 3 5 磷酸二酯键连结 由一个核苷酸的戊糖环第 3 位羟基与另一个核苷酸的戊糖环第 5 位的磷酸以酯键相连 具有一 定的方向性 碱基间遵循碱基互补配对原则 即腺嘌呤 A 一定与胸腺嘧啶 T 配对 鸟嘌呤 G 一定与胞嘧啶 C 配对 如图 1 4 因为它是指组成核酸的核苷酸之间连键的性质和排列的顺 序 所以 DNA 的一级结构也被称为 DNA 碱基序列 图图 1 4 核酸一级结构模型核酸一级结构模型 第二 DNA的二级结构 它是指磷酸和碱基按照一定顺序排列时 由于扭转角度和各种碱 基排列方式不同而产生各种各样构型的DNA DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式 它是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构 由Watson和Crick两位科学家于 1953年提出来的一种结构模型 在不同湿度和盐浓度下 DNA的双螺旋有着不同的构象 DNA 的二级结构分为两大类 一类是右手螺旋 如A DNA B DNA C DNA D DNA等 另一类是 左手双螺旋 如Z DNA 双链DNA 的构象与其核苷酸序列和碱基组成有密切关系 一般地 含 随机的碱基组成和序列的DNA双螺旋分子通常只能形成A B C 构型 但严重重复的寡聚核苷 酸则可形成其它的构型 如D E Z 和P 构型 改变一定的外界环境条件 如温度 相对湿度 盐的浓度以及有机溶剂等可以使这些构型进行相互的转化 并且这些转变从本质上都是改变核 酸分子的内在运动来实现的 共 32 页 第 5 页 装 订 线 图图 1 5 A DNA B DNA 和和 Z DNA 第三 DNA的三级结构 它是指DNA中单链与双链 双链之间的相互作用形成的三链或四 链结构 由DNA双螺旋进一步扭曲 包括线状双链中间可能有的扭结和超螺旋 多重螺旋及环 状DNA中诸如超螺旋和连环之类的各种拓扑学状态 在双螺旋DNA的大沟中存在多余的氢键给 体和受体 这些氢键给体和受体可以和专一的结合分子 如蛋白质 发生相互作用 形成专一的复 合物 也可以与单链DNA分子结合形成三螺旋DNA 三螺旋DNA一般是由一条寡核苷酸链通过 与双链DNA形成Hoogsteen 键或反Hoogsteen 键 在其大沟处紧密缠绕而成 三螺旋DNA 的组 成结构基元是三碱基体 这些碱基体也具有专一性 具体体现在T C G A 分别要接在 AT GC GC 和AT 碱基对上 见图1 6 形成三螺旋DNA的第三条链的抗酶括性 水溶性 脂溶性和毒副作用等因素直接影响其作为治疗药物的可能性 因而合成能抗核酸酶能力强 水 溶性和脂溶性适当 毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA稳定性的主链修饰方法仍 是目前的研究热点 图图 1 6 三螺旋三螺旋 DNA 结构结构 共 32 页 第 6 页 装 订 线 1 4 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系 1 4 1 G G 四链体四链体 G 四链体 G quadruplex 是一类特殊的DNA二级结构 在基因组中的一些鸟嘌呤富集区域 具有形成这一特殊结构的倾向 这些区域包括端粒末端G重复序列 以及一些重要基因的启动子 区域 因此G 四链体的形成或拆散可能涉及到体内的一些重要生理过程的调控 比如细胞凋亡 细胞增殖 信号转导和肿瘤形成等 此外 G 四链体结构作为一种特殊的DNA二级结构 与普 通双链具有显著的结构差异 可以成为药物选择性识别的靶点 因此 研发与G 四链体相互作 用的小分子抗癌药物受到了广泛的关注 四链体结构是由富含G DNA单链 在特定离子强度和pH值条件下 由单链之间或单链内对 应的G残基形成Hoogsteen碱基配对 从而使四条或四段富G DNA单链旋聚成一段特殊的DNA二 级结构 由于富G DNA中的G残基都是成串排列的 因此 当四条或四段富G单链DNA的G残基 并肩形成Hoogsteen碱基配对时 就形成了一个由4个G残基的杂环平面联合形成的G quartet平面 在4条链中相应的的G之间形成的四分体平面层层堆叠 就形成一段极其稳定的四链体DNA结构 见图1 7 由于这段四链体是以G残基为主形成的 故称为G quadruplex 其中每个G碱基既是 氢键的受体 又是氢键的给体 他们在结构上是等价的 在两个相邻的四碱基体的中央会形成 一个空腔 空腔内有负电性的羰基氧存在 使得此处易于结合阳离子 四链体四链体之间通过 作用相互堆积结合在一起 G quadruplex特殊结构使得它能够成为特异性的DNA靶点 NN N N R HNH H O N N N N R H N H H O N N N N R H N H H O NN N N R HNH H O 图图 1 7 G quadruplex 结构结构 大量研究表明含不同 G 序列所形成的四螺旋结构是不同的 即使是相同的序列也可以按不 同的方式进行组装 G 四链体 DNA 可以通过单链 双链以及四链形成三种不同的四螺旋结构 每种结构又有多种异构体 见图 1 8 大量研究表明含不同 G 序列所形成的四螺旋结构是不 同的 即使是相同的序列也可以按不同的方式进行组装 现在普遍认为通过控制适当的条件 如温度 DNA 浓度 缓冲液中的 Na 和 K 的浓度等可以改变 G 四链体的构型 共 32 页 第 7 页 装 订 线 图图 1 8 几种典型的几种典型的 G 四链体结构四链体结构 a 分子间四聚体结构 分子间四聚体结构 平行平行 b 分子间二聚体邻位发夹型结构 分子间二聚体邻位发夹型结构 反平行反平行 c 分子内椅状结构 分子内椅状结构 反平行反平行 d 分 分 子内蓝状结构子内蓝状结构 反平行反平行 e 分子内螺旋桨状结构 分子内螺旋桨状结构 平行平行 f 分子内混合型结构 分子内混合型结构 1 4 2 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系 端粒是由高度重复序列的端粒DNA 和端粒结合蛋白组成的复合物 20世纪三四十年代 Hermann Muller 和Barbara McClintock 同时提出了端粒的概念 它是染色体末端的一种特殊结 构 能防止染色体DNA 降解 末端融合 缺失及非正常重组维持染色体的完整和稳定 并保证 细胞正常分化 端粒的主体是双螺旋结构 富GT链与富CA链配对 但3 末端突出为一段单链悬 挂 由于缺乏模板的引导 染色体合成过程中传统的DNA聚合酶就无法完全合成这个末端悬挂 从而造成端粒缩短 这就是所谓的 末端复制问题 端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊的核蛋白复合体 由高度重复序列的端粒 DNA 和端粒 结合蛋白组成 17 不同物种的端粒DNA序列存在差异 但都以富含鸟嘌呤 G 的重复序列为特征 人的端粒约有15 kb 反复串联的TTAGGG 构成的 并且以50 200bp 次分裂进行缩短 主要组 成部分为5 15 kb 长的双链DNA 和3 末端100 200 bp 长的G 单链悬垂 G overhang DNA 端粒 的主体是双螺旋结构 富GT 链与富CA 链配对 但3 末端突出为一段单链悬挂 这段单链在 名为Shelterin 18 Telosome 19 的蛋白结构催化下折回到端粒内部双链 并将该端区域的一段自身 链置换出来 取而代之与互补链配对 形成T loop telomere loop 结构 而3 末端单链被 包埋 在T loop中 端粒末端便形成了一个与外界隔绝的闭合结构 正是由于这个闭合结构 端粒显现 出了对于染色体的稳定及其基因组的完整非常重要的作用 它为染色体末端提供保护性 防止 染色体互相融合 重组及一些外切酶 连接酶的作用 防止DNA的损伤 并计数在线性DNA复 制时出现的末端DNA片断的丢失 同时 这种结构也使端粒酶不可能持续与端粒3 末端单链发 生作用 从而保证了端粒长度的恒定 共 32 页 第 8 页 装 订 线 图图 1 9 左图为人染色体末端的端粒左图为人染色体末端的端粒 DNA 右图为人端粒结构示意图 右图为人端粒结构示意图 正常细胞的端粒随着细胞分裂进行性缩短 在每一次的复制循环中端粒都要减少50 100个碱 基对 细胞在进行大约50次分裂后就开始衰亡 端粒的长短在细胞癌变和衰老中起着重要作用 而端粒的长短可由端粒酶调节 1985 年Greider 和Blackburn 首次从四膜虫细胞提取液合成端粒 的实验中 发现了端粒酶活性并同时证实了端粒酶具有维持端粒长度的作用 端粒酶是一种核 酸蛋白质复合物 它能以自身RNA为模板 将真核生物染色体末端端粒DNA加以延伸的酶 所 以它又被称为特化RNA依赖性DNA聚合酶 反转录酶 端粒末端转移酶 端粒酶由三个部分组 成 包括端粒酶RNA hTR 逆转录酶催化亚基 hTERT 和端粒酶其它聚合蛋白 TEP1 2 端粒 酶的生物功能是合成染色体末端的端粒 是一种依赖于RNA 的特殊的DNA 聚合酶 属于逆转 录酶类型 在胚胎发育期 端粒酶的活性很高 而在成熟体细胞中端粒酶的活性则会被关闭 以此来调控细胞的生长 分化和衰老 但是在大部分肿瘤细胞 85 中 端粒酶则表现出了很 高的活性 而在癌周围组织和正常组织中端粒酶几乎是没有活性的 在正常的体细胞中 端粒 酶的活性得到抑制 所以细胞每分裂一次 端粒就会缩短一些 当达到一个临界长度时 细胞 染色体就会失去稳定性 然后细胞将发生衰亡和凋亡 而在肿瘤细胞中 端粒酶的活性被激活 使得它可以维持端粒的长度 从而维持肿瘤的继续分裂 增殖和生长 因此这个细胞不能进入 正常的老化和衰亡 从而获得一种永生性 由此说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持分裂增殖 具有密切的关系 因此 以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究已成为一种新的药物作 用靶点 而且极有希望成为最安全 有效的治疗肿瘤的理想途径 端粒酶抑制剂的研究主要针对其不同的组分及不同的结构 由于 G 四螺旋能阻断 RNA 聚 合酶 因此当基因密码区的富含 G 重复序列形成 G 四螺旋而又不易解聚时 会起到抑制 RNA 聚合酶的作用 从而引起早期转录的停止 靶向端粒酶集中在以下三个方面 第一个方面以端 粒酶 RNA 为靶点 第二个方面是抑制端粒酶逆转录酶活性 第三个方面是 G 四链体的稳定剂 第四个方面是开发端粒酶抑制剂的新靶点 G 四螺旋结构的稳定剂或 G 四螺旋形成诱导剂的优 势在于 G 四螺旋结构具有特异性 故具备更强的选择性 从而大大降低了传统化疗药物的毒性 由此 以 G quadruplex 为靶点来寻求能够诱导 稳定或识别四链体结构的小分子是当前研究开 发抗肿瘤药物重要途径之一 综合以上所述 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系可以归结为下面这个流程图 共 32 页 第 9 页 装 订 线 图图 1 10 G 四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系示意图四链体与端粒 端粒酶和肿瘤的关系示意图 1 5 本文所做的工作本文所做的工作 本文将合成一种顺铂配合物 用荧光光谱 紫外光谱观察金属配合物与DNA的G 四链体的 键合作用及性质 主要做了以下工作 1 合成配体 dpq df 2 合成铂配合物 3 对所合成的配合物进行核磁与质谱检测 4 用荧光光谱 紫外光谱观察两种不同辅助配体的钌配合物与 DNA 的 G 四链体的键合 作用及性质 共 32 页 第 10 页 装 订 线 2 理论部分理论部分 2 1 配合物与配合物与 DNA 作用的基本形式作用的基本形式 作用于G 四链体的小分子配体是通过识别和稳定G 四链体而抑制端粒酶活性的 研究表明 小分子配体和不同结构的G 四链体结合模式不同 分子模拟显示 配体可以非共价键结合形式 堆积在末端G四分体上 结合在沟上 环上或插入两个G四分体平面之间 据文献报道 小分子 配体与G 四链体的作用模式主要有两种 外部堆积模式和插入模式 如图2 1所示 1 外部堆积模式 即小分子配体和 G quadruplex 的末端 G 四链体形成共轭结构 2 插入模式 即小分子配体插入到两个 G 四链体之间 3 非特异结合模式 通过氢键和静电作用于沟槽 Loop 上 由于溶液中小分子配体G 四链体之间的结合处于动态平衡状态 导致NMR图谱很难解析 因此 关于复合物的NMR结构数据非常缺乏 给研究小分子配体的结合模式带来了困难 总的 来说 插入模式由于只有一部分碱基和配体结合 易失衡 从而导致整个G quadruplex结构的分 解 外部堆积模式来有许多结构特点来维持整个分子能量稳定 末端G 四分体更容易与配体形 成共轭结构 结合位点较易识别 动力学稳定 化合物的作用模式更倾向于外部堆积模式 图图 2 1 小分子与小分子与 G 四链体的作用模式四链体的作用模式 a 外部堆积模式外部堆积模式 b 插入模式插入模式 c 非特异性结合非特异性结合 2 2 DNA 与配合物作用的研究方法与配合物作用的研究方法 2 2 1 光谱学方法光谱学方法 2 2 1 1 紫外紫外 可见光谱或电子光谱可见光谱或电子光谱 由于比较灵敏 直观 方便 它是研究金属配合物与DNA作用最常用的方法之一 一般来 说 DNA加入金属配合物后 会对配合物的光 氧化还原等化学物理性质产生影响 通过研究 DNA加入前后配合物性质的变化可对配合物与DNA的相互作用进行初步研究 吸收光谱是研究 配合物与DNA 相互作用比较直接的一种方法 配合物与DNA 结合后 使合物所处的环境发生 改变 吸收光谱波长和吸收强度发生变化 配合物与DNA 作用方式不同 则波长和吸收强度变 化不同 依据电子跃迁的机制 可将配合物的电子吸收光谱分为三种类型 共 32 页 第 11 页 装 订 线 1 以金离子Mn 为中心的d d 跃迁所产生的配位跃迁光谱 2 配体至金属或金属离子 LMCT 或金属离子至配体 MLCT 的电荷迁移光谱 简称 荷移光谱 3 以配体L 为中心的配体间的电子转移光谱 IL 其中金属离子向配体的电子跃迁发生 在金属离子具有充满的或接近充满的t2g 轨道 而配体具有最低空 轨道的配合物中 核酸分子由于其嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系 所以在紫外区260 290 nm 处有特征的 吸收 这种吸收随分子中各碱基的种类 所占比例以及碱基间的堆积方式等的改变而有所不同 一般来说 结构越有序 吸收值越低 因此 我们可利用紫外吸收光谱对上述各核酸分子结构 的形成进行初步判断 当配合物插入到DNA 碱基对时 对应的吸收峰产生明显的减色效应 并 伴有一定程度的红移 2 2 1 2 荧光光谱荧光光谱 荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段 荧光物质在激发光的激发下 由基 态跃迁到较高的能级 激发态 后 首先通过内转换过程消耗一部分能量 回到第一电子激发态的 最低振动能级 同时以光量子的形式发射能量 即为荧光 配合物以插入方式与 DNA 作用后 由于它的振动模式受到抑制 或免受水分子的淬灭 配合物受到了 DNA 碱基疏水环境的保护 其发光强度一般会增强 并根据强度的变化来判断与 DNA 作用的强弱 2 2 1 3 圆二色谱及圆二色谱及 DNA 解旋技术解旋技术 圆二色谱可以检测有无旋光物质的存在 51 52 或比较左 右旋物质的混合物中哪种含量更 多 测定透析后的配合物的 CD 光谱 还可帮助确定配合物与 DNA 的相互作用有无异构选择性 G 四链体或 I motif 结构在圆二色谱中有着特殊的峰结构 平行型 G 四链体在 265nm 附近有正 的最大吸收峰 240nm 附近有负的最大吸收峰 反平行型的 G 四链体在 295nm 附近有最大正吸 收峰 260nm 有最大负吸收峰 混合式的 G 四链体构型则包括了 290nm 附近的正吸收以及特 征的 265nm 附近的肩峰 加入配合物后 会使其吸收峰发生移动并改变其强度 明显影响 G 四 链体的 CD 光谱 这样的一种现象便有了一定的选择性变化 更容易区分 G 四链体的构型转化 反应配合物和 DNA 的结合模式 又由于 CD 光谱法灵敏度高 样品在很低的浓度下就可以检测 到特征吸收 圆二色谱成为一个很有效的检测手段 利用圆二色谱仪同时可以做热变性的实验 DNA 的变性指 DNA 分子由稳定的双螺旋结构 松解为无规则线性结构的现象 核酸由多链结构 双螺旋或四螺旋 变为单链结构的中点温度反应 了该结构的稳定性 该温度的变化也反应了结构稳定性的变化 配合物与 DNA 作用方式不同 则 DNA 熔化温度 Tm 变化程度就不同 当配合物与 DNA 以插入方式作用时 DNA 熔化温度 Tm 变化最大 2 2 1 4 其他光谱法其他光谱法 线二色谱 LD 和电二色谱 ED 线二色谱和电二色谱都是采用与固定光轴方向 在流动梯度 体系中旋转和外加电场 使 DNA 螺旋轴取向固定 平行或垂直的平面偏振光 测量结合 DNA 后 的配合物对垂直和平行于 DNA 的线偏振光的不同吸收 瞬时共振拉曼光谱 可以探测微环境的变化对配合物激发态的性质或行为的影响 从而可 以用来研究配合物与 DNA 的作用机理 共 32 页 第 12 页 装 订 线 2 2 2 流体力学方法流体力学方法 应用流体力学技术测试 DNA 双螺旋长度变化 在确定小分子化合物与 DNA 作用模式方面 流体力学方法 如粘度 53 沉降速度及在凝胶中的泳动速度等 有其独特的应用 2 2 3 密度泛函计算与分子模拟密度泛函计算与分子模拟 密度泛函理论能够很好地考虑到体系中电子的相对能量 特别适合于单线态金属配合物的 计算 由于密度泛函方法考虑了电子相关 计算速度快 并且能有效地估算配合物的分子结构 电子结构及其与 DNA 相互作用的前线分子轨道 引起了理论化学家的注意 密度泛函理论的计 算对于科学家们设计新的功能独特的配合物有着重要的理论指导意义 此外 还有 pH 滴定 热力学方法和电化学方法等 不过这些方法在研究小分子化合物与 DNA 键合机理方面不太常用 共 32 页 第 13 页 装 订 线 3 实验部分实验部分 3 1 引言引言 本章介绍了铂多吡啶配合物的合成步骤 及其配合物的表征 在表征过程中特别是质谱方 面上 有些系列的配合物均与应得的分子量有偏差 说明反应过程中可能发生了其他的副反应 所以实验步骤还有待探索 现列出实验步骤 以供参考 指正 预防此后的科研出现不必要的 重复工作 本文设计合成得出了铂配合物 ptap Pt en PF6 2 通过核磁 质谱表征方法证明为此种配 合物 3 2 药品和仪器药品和仪器 3 1 1 实验试剂实验试剂 试剂名称纯度级别生产厂家或提供商 1 10 邻菲咯啉 AR国药 盐酸羟胺AR国药 甲醇AR国药 氯仿AR国药 钯碳催化剂 AR国药 丙酮AR国药 乙醇 AR国药 氢氧化钾AR国药 浓硫酸 AR国药 石油醚AR国药 氢氧化钠 AR国药 二甲基甲酰胺AR国药 乙二醇AR国药 四氯合铂 酸钾AR国药 乙二胺AR国药 乙二醇AR国药 六氟磷酸铵98 阿拉丁 乙醚AR国药 氯化钾AR国药 氯化钠AR国药 Tris 碱AR国药 3 1 2 实验仪器实验仪器 核磁共振波谱 Brucker 400M 核磁共振波谱仪记录 电喷雾质谱 ES MS 用 LCMS 2010A 型液相色谱 质谱联用仪 高纯水用 SZ97 自动三重蒸馏水发生器获得 共 32 页 第 14 页 装 订 线 电子吸收光谱用 Lambda Bio 40 紫外分光光度计测量 荧光光谱用 Hitachi FP7000 荧光光度计测量 3 2 配合物的合成及表征配合物的合成及表征 3 2 1 配体的合成配体的合成 1 5 硝基邻菲罗啉的合成 N N N N 150 reflux H2SO4HNO3 NO2 Molecular Weight 180 21Molecular Weight 225 20 称取邻菲罗啉 5g 置于 100mL 圆底烧瓶 加入 30mL 浓硫酸 缓慢升温至 150 再逐滴加 入 15mL 浓硝酸 反应物继续回流 3 小时后停止反应 冷却至室温 将反应混合液倾入含 500g 冰的烧杯中 用事先配制好的 NaOH 溶液 50g NaOH 溶于 200mL 左右蒸馏水 调节反应液的 pH 值至接近中性 pH 5 抽滤得浅黄色固体 用冰水洗涤三次以上 所得产物在 50 干燥后 备用 产率 87 2 5 氨基 6 硝基邻菲罗啉 N N NO2 NH2OHHCl KOH EtOH N N NO2 NH2 Molecular Weight 225 20 Molecular Weight 240 22 将 4g 17 8mmol 5 硝基 6 氨基邻菲罗啉溶于 100mL 无水乙醇并加热回流 待反应物全溶 之后加入 8g 118 9mmol 盐酸羟胺 此时析出浅黄色悬浮固体 并在 45 分钟之内 往上述混 合液中滴加 KOH 的乙醇溶液 9g KOH 溶于 100mL 无水乙醇 反应混合物逐渐变为棕黄色 继续回流 30 分钟后停止反应 冷却至室温后 将反应液倒入 300 600mL 冰水中 静置一夜后抽 滤 滤饼分别用水 甲醇和氯仿洗涤后干燥 得产物 1 6g 产率 35 3 5 6 二氨基邻菲罗啉 共 32 页 第 15 页 装 订 线 N N NO2 NH2 N2H4H2O Pd C N N NH2 NH2 Molecular Weight 240 22Molecular Weight 210 23 将 0 4g 5 硝基 6 氨基邻菲罗啉溶于 400mL 无水乙醇 加热回流至全溶 再加 0 2g Pd C 催 化剂 10 Pd 搅拌混合均匀 并在 15min 之内逐滴加入 4mL 水合肼 80 继续回流 1 小 时后停止反应 趁热过滤 旋蒸浓缩滤液 再加入过量的石油醚后析出黄色固体 抽滤后用石 油醚洗涤滤饼 真空干燥 产率 68 4 双呋喃基 dpq df 的合成 N N NH2 NH2 O O O O N NN N O O Chemical Formula C22H12N4O2 Molecular Weight 364 36 Chemical Formula C12H10N4 Molecular Weight 210 23 Chemical Formula C10H6O4 Molecular Weight 190 15 DMF 140 2d 5 6 二氨基 1 10 邻菲罗啉 0 25g 1 2mmol 2 2 双呋喃二酮 0 23g 1 2mmol 溶 于 20mLDMF 置于 100mL 三颈瓶中 在氮气保护下回流 2 天 反应结束后 冷却抽滤 所得固 体用温甲醇洗涤 干燥 产物黄绿色絮状固体 净重 0 25g 产率 57 3 2 2 铂配合物的合成铂配合物的合成 对于铂配合物的合成 设计了如下一种 并对其进行了合成 因时间关系 没有对其进行 再次的纯化 1 dpq df PtCl2的合成 将 dpq df0 1822g 0 5mmol 加入一圆底烧瓶中 向其中加入 35mL 乙二醇加热近沸 全部溶 解后 缓缓加入用 5ml 高纯水溶解的 0 2090g 0 5mmol 的 K2PtCl4 梅红色晶体 130oC 加热回流 6 小时 出现红棕色沉淀 将其自然冷却至室温 避光放置过夜 过滤 用水洗涤 去掉未反应 的 K2PtCl4 然后用少量乙醇 乙醚洗涤并进行干燥 最后得红棕色粉末固体 0 2432g 产率 77 15 2 dpq df Pt en PF6 2的合成 将乙二胺 240 L 加入混有 20mL 乙二醇和 0 2400g dpq df PtCl2 的圆底烧瓶中 加热 100oC 回流 3h 未全部溶解 待反应完成后 加少量水稀释 过滤出不溶物 为反应的配体 向滤液中加入 NH4PF6饱和溶液 产生沉淀 静置一夜后 用慢速滤纸 因沉淀颗粒太小 两层进行过滤 用乙 醇 乙醚洗涤干燥 得到咖啡色固体 0 2804g 产率 81 共 32 页 第 16 页 装 订 线 3 dpq df Pt en PF6 2的表征 图图 3 1 dpq df Pt en PF6 2的的 1H NMR 谱 谱 共 32 页 第 17 页 装 订 线 图图 4 2 ptap Pt en PF6 2的质谱示意图的质谱示意图 3 3 不同辅助配体的多吡啶配合物与不同辅助配体的多吡啶配合物与 G 四链体四链体 DNA 的相互作用的研究的相互作用的研究 3 3 1 缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 缓冲溶液用高纯水配制 缓冲溶液 1 100mM KCl 10mM Tris pH 7 缓冲溶液 2 100mM NaCl 10mM Tris pH 7 3 3 2 配合物与配合物与 DNA 浓度的确定浓度的确定 3 3 2 1 配合物浓度的确定配合物浓度的确定 配合物 1 Ru bpy 2 dpqdf 2 配合物 2 Ru phen 2 dpqdf 2 称取一定质量配合物分别用高纯水和缓冲液 1 2 3 4 溶解 3 3 2 2 DNA 的处理和浓度确定的处理和浓度确定 1 富 G 单链 DNA 取一定质量富 G 单链 DNA 溶于高纯水 放入 4 冰箱保持 24h 备用 浓度确定 用紫外分光光度计测量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260 摩尔消光系数为 2 285 105m3cm 1 DNA 浓度 DNA K A260 2 285 105 K 是稀释倍数 单位是 mol L 1 2 富 G 四螺旋 DNA 共 32 页 第 18 页 装 订 线 取两份一定质量富 G 单链 DNA 核苷酸序列为 5 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3 分别溶于缓冲液 1 及缓冲溶液 2 中 缓冲溶液 476uL 密封加热到 90 并保持 5 分钟 然后 自然冷却到室温 放入 4 冰箱中保持 24 小时 备用 浓度确定 用紫外分光光度计测量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260 摩尔消光系数为 2 285 105m3cm 1 取 DNA50uL 再加入 4950 的缓冲液 稀释倍数为 100 倍 DNA 浓度 DNA K A260 2 285 105 K 是稀释倍数 单位是 mol L 1 3 2 2 3 配合物与配合物与 G 四链体相互作用的紫外四链体相互作用的紫外 可见光谱滴定可见光谱滴定 在紫外 可见吸收光谱仪的双光路系统中 先往参比池中加入 475uL 缓冲溶液做参比 基线 稳定后 往样品池中加入浓度为 10uM 的配合物溶液 25uL 用微量进样器每次往参比池和样品 池中加入 5uL 的 DNA 储备液 混匀 5min 后 使 DNA 在配合物溶液中的浓度比值不断增加 直至饱和 在 200 800nm 范围内检测配合物的电子吸收光谱的变化 3 2 2 4 配合物与配合物与 G 四链体作用的荧光光谱滴定四链体作用的荧光光谱滴定 在样品池中加入 1950uL 的缓冲溶液以及 50uLDNA 储备液 测定溶液在 620nm 440nm 激发 处发光强度 随后样品池中每次加入 10uL 浓度为 200uM 的配合物 1 2 溶液 用移液 枪反复吸吐 混匀 5 分钟后检测荧光情况 如此反复 滴加 10 次 共 32 页 第 19 页 装 订 线 4 结果和讨论结果和讨论 4 1 配合物与配合物与 G 四链体电子吸收光谱研究四链体电子吸收光谱研究 紫外光谱是研究小分子配合物与DNA相互作用的一种最简便 最常用的技术 价键理论认 为 每个分子都有一系列严格分立的能级 处于低能级的分子受到光的能量激发时 可吸收特 征频率的光子而跃迁到较高的能级 进而产生吸收光谱 许多小分子配合物本身在紫外可见光 区有特征吸收峰 当小分子配合物与DNA 相互作用时 通常会出现相应的特征变化 表现为吸 收谱带变宽 吸收峰红移 或蓝移 及减色效应 这种现象的产生往往来源于小分子配合物发色 团与DNA 碱基电子云的强烈相互作用 因此 紫外可见吸收光谱可以用来研究小分子配合物与 G 四链体DNA 的相互作用 进而根据其产生的相应特征变化推测其作用模式 在紫外光谱图中 图4 1 4 2 4 3 4 4 300 nm 以下的吸收峰为配体间的 跃迁峰 IL 而可见光区450 nm 附近的吸收峰为配合物 的MLCT 峰 可以归属为Ru d dpqdf 的 跃迁吸收 但是由于两个吸收峰所在波长比较接近 因此在图中只表现为一个宽的吸收带 配 合物与两种端粒DNA作用后的LC 峰和MLCT 峰表现出了明显的减色效应和一定程度的红移现 象 因为DNA 在可见光区没有吸收 推测配合物1 2在K Na 缓冲溶液环境中都能与G 四链 体发生某种相互作用 同时 一般认为配合物与DNA 作用时 峰值减小并伴随红移 电子吸收值改变越大 则配 合物与DNA 作用越强 从图中可以看出 对于K 缓冲条件下 以MLCT 峰看 配合物与DNA 作用后的减色率比在Na 缓冲条件下的减色率大 产生以上现象的原因可能是由于K 环境下形成 的DNA 微观结构更有利于其与配合物的键合 300400500 0 1 abs Wavelength nm 合合合 5uL DNA 10uL DNA 15uL DNA 20uL DNA 25uL DNA 图图4 1 钾离子缓冲溶液配合物钾离子缓冲溶液配合物1与端粒与端粒G quadruplex作用的紫外滴定曲线作用的紫外滴定曲线 Ru 10uM 450nm左右的吸收峰变化是由于左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加浓度的增加 从从0 1 2 3 4 5 M 共 32 页 第 20 页 装 订 线 300400500 0 1 abs Wavelength nm 合合合 5uL DNA 10uL DNA 15uL DNA 20uL DNA 25uL DNA 图图4 2 钠离子缓冲溶液配合物钠离子缓冲溶液配合物1与端粒与端粒G quadruplex作用的紫外滴定曲线作用的紫外滴定曲线 Ru 10uM 450nm左右的吸收峰变化是由于左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加浓度的增加 从从0 1 2 3 4 5 M 300400500 0 1 abs Wavelength nm 合合合 5uL DNA 10uL DNA 15uL DNA 20uL DNA 25uL DNA 30uL DNA 35uL DNA 40uL DNA 图图 4 3 钾离子缓冲溶液配合物钾离子缓冲溶液配合物 2 与端粒与端粒 G quadruplex 作用的紫外滴定曲线作用的紫外滴定曲线 Ru 10uM 450nm左右的吸收峰变化是由于左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加浓度的增加 从从0 1 2 3 4 5 6 7 8 M 共 32 页 第 21 页 装 订 线 300400500 0 1 abs Wavelength nm 合合合 5uL DNA 10uL DNA 15uL DNA 20uL DNA 25uL DNA 30uL DNA 35uL DNA 40uL DNA 图图 4 4 钠离子缓冲溶液配合物钠离子缓冲溶液配合物 2 与端粒与端粒 G quadruplex 作用的紫外滴定曲线作用的紫外滴定曲线 Ru 10uM 450nm左右的吸收峰变化是由于左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加浓度的增加 从从0 1 2 3 4 5 6 7 8 M 四种配合物在260 280 nm 附近出现较强的吸收峰 在450 nm 附近出现较弱的的吸收峰 均 可归属为配体中的 跃迁 450 nm 附近的吸收峰对应于金属钌配位体电荷转移 MLCT 从图中显示 随着AG3 T2AG3 3浓度的逐渐增加 配合物在紫外区吸收光谱都能够出现明显减色 现象和一定红移 但MLCT 峰的峰值与位移变化不大 以上信息表明配合物可以与AG3 T2AG3 3 的碱基发生强烈的 作用 根据图4 5 4 6 4 7 4 8 DNA滴定缓冲溶