青霉素的生产.doc

南通职业大学毕业设计（论文） 青霉素的生产工艺流程的研究1.引言青霉素（Benzyl penicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。结构式：工艺流程发酵工艺流程丝状菌的青霉素发酵工艺流程：沙土管斜面母瓶（孢子培养，25，67d）大米孢子斜面（孢子培养，25，67d）种子罐（种子培养，25，4045h）繁殖罐（种子培养，25，1315h）发酵罐（发酵，26，67d）放罐球状菌的青霉素发酵工艺流程：冷冻管斜面母瓶（孢子培养，25，68d）大米孢子斜面（孢子培养，25，810d）种子罐（种子培养，28，5060h）发酵罐（发酵，26，67d）放罐2、工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和 钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的 流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。 （2）温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至 青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 （3） pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流 加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 （4）溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流 加控制的一个参考指标。（5）菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。 （6）菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。 （7）菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高),发酵罐体积产率甚至高于前者。 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。 3、 工艺控制要点（1）种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内 ,26 C 培养 56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为 主的二级种子罐内,27C 培养 24h, 菌丝体积 10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 (又称生产米), 亲米和生产米均为25 C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 C冰箱内。 工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、 饴糖为主的种子罐内,28 C 培养 50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在 100- 130m, 每毫升的球数为 6万 -8万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。（2） 培养基成分的控制 a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。 目前生产上普遍采用的是淀粉水 解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 进行流加。 b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙 酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害。d无机 盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在30g/ml 。（3）发酵培养的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。c. pH 值控制 对pH 值的要求视不同菌种而 异, 一般为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄糖来 控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。d. 温度控制 前期 2 5- 2 6 C, 后期 23 C, 以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e. 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 泡敌 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢。g. 发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称 镜检 ,根据 镜检 中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间, 以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙古稠, 增加下一步提纯时过滤的困难。因此, 生产上根据 镜检 判断, 在自溶期即将来临之际, 迅速停止发酵, 立刻放罐, 将发酵液迅速送往提炼工段。提取工艺流程青霉素的精制1、浓缩在抗生素提取和精制的过程中，常需要通过蒸发将发酵滤液或提取液进一步浓缩，以利于后序操作。抗生素生产中有真空浓缩和薄膜蒸发浓缩。2、干燥干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高产品的稳定性，有利于产品的加工、储存和使用。常用的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、气流干燥、冷冻干燥等。此外也有使用常压干燥、固定床干燥及红外线干燥等。3、脱色和去热原 提炼往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一个单元操作。这一步操作的好坏，不仅影响下一道工序，更重要的是关系到成品的色极及热原试验等质量指标。用活性碳可除去各种色素，同时也能出去热原。4、结晶抗生素的精制过程中常常通过结晶的方法来制得较高纯度的成品。抗生素的精制方法很多，生产中常用的结晶方法有以下几种：改变温度结晶、利用等电点结晶、加成盐剂结晶、加入不同溶剂结晶、共沸结晶。另外还有盐析法、中间盐转移法、晶体洗涤法等几种精制方法。重结晶是进一步提纯精制抗生素的有效方法，通过重结晶方法可获得高纯度抗生素产品。操作规程6.1发酵工艺过程6.1.1正常发酵过程6.1.2出料停止进空气停搅拌关闭所有进料，开阀出料6.1.3发酵过程中PH值低调节PH值开大氨水流量PH值指标6.1.4发酵过程中PH值高关闭进氨水开大补糖阀调节PH值6.1.5发酵过程中溶解氧低开大进空气阀V02调节溶解氧大于30%6.1.6残糖浓度低开加糖阀补糖6.1.7发酵过程中温度高开通冷却水进水冷却温度指标6.1.8泡沫高添加消泡剂泡沫高度降低到30CM6.2提炼工艺过程6.2.1预处理操作6.2.2一次BA萃取操作6.2.3一次反萃取操作6.2.4二次BA萃取操作6.2.5脱色罐操作6.2.6结晶罐及抽滤、干燥操作对劳动保护要求1. 所有进入工作现场的工作人员必须穿戴好劳动保护用品和遵守劳动保护条例，没有穿戴劳动保护的人员不允许进入工作现场。外来人员只有穿戴必要的劳动保护之后才可进入现场；2. 所有的劳动保护用品必须定期检验，不和格的劳动保护用品不允许佩带；3. 未满18周岁或未经培训的人员不允许操作本系统的所有设备。4. 所有的设备应有铭牌和标识。电气设备和化学用品以及其它可对人身造成危害的设备和用品必须要有警告标志，以提醒相关的工作人员；5. 本系统的电动、机械设备必须保持运行良好，并由相关的专业人员定期检测、维修、保养；6. 保持工作场所清洁，整齐。工具、仪表摆放有序。工作人员不乱吐痰和不乱扔垃圾；7. 现场的垃圾应排放到指定地点，生活垃圾和工业垃圾应分类处置。有毒和化学废品应按国家的相关的法规处理；8. 当班工作人员每天清扫工作现场1次，确保现场环境整洁；9. 工作中产生的可燃性废品应集中收集，应集中烧毁，不得倒入垃圾箱，以免污染环境和引起火灾；10. 设备清洗时，清洗管道的污水必须排入废水处理场，产生的化学药剂的残液不得随意倾倒，应按规定收集处理，不得破坏环境和影响厂区卫生；11. 中试过程中，系统设备产生的废水不允许直接排放，应排入指定的排水口；12. 试验现场应配备快速冲洗水槽、硼酸和碳酸氢钠清洗液；13. 现场操作人员除佩戴相应的劳动保护用品外，应佩戴防护目镜；14. 操作人员在接触氰化贫液时，应戴胶皮手套、口罩，工作完成后应立即洗手。提出生产工艺方面所面临的问题及改进方法废液处理过程中存在的问题在废酸水的蒸馏过程中，所得醋酸丁酯的酯含量偏低，不能满足直接套用的要求，因此，一般采用部分酯化后混合使用的方法处理。为了找到引起废酸水塔采出成品酯含量偏低的原因，笔者对几种废液的组成进行了分析，相关数据见表1。对表1数据分析可知，废酸水塔成品酯含量偏低可能的原因有以下几种：I)尾气吸收液中含有一定量的丁醇，该部分废酸液进塔时带人部分丁醇，导致成品的酯含量下降；2)提取岗位的废酸水酸性较强，而该部分废水在整个废水中所占的比例较大，从而导致整个废水系统呈酸性，鉴于醋酸丁酯的特性，在酸性条件下高温蒸馏时可能发生部分醋酸丁酯分解产生丁醇而影响成品的酯含量；3)直接套用的碱化分相丁酯在下一次进入废水系统时引起成品丁酯的酯含量下降。1)对于尾气吸收液带入丁醇的问题，其解决方法应是避免丁醇的带入，也就是说不再将这部分料液混入到废水系统中，而是单独处理。具体到处理方案可以选择单独蒸馏后进人酯化塔进行酯化。但是要做到这一点，除需增加废液储存设备外，还需要新增精馏塔。鉴于现场空间限制，该方案不可行。2)为了消除碱化分相丁酯对成品丁酯酯含量的影响，采取了对分相丁酯进行水洗的处理方法。实验证明，经过水洗再分相后的丁酯相，蒸馏前后酯质量分数基本不变，而水洗在蒸馏前后酯质量分数也无明显变化。具体数据见表5和表6。因为这种处理方式只需要新增一个搅拌罐，结合实际情况可以满足要求，同时精馏塔也可完成对水洗水的蒸馏，因此对碱化分相丁酯进行水洗是切实可行的解决措施。 产品用途青霉素是一种杀菌力强，毒性小，应用广的抗菌素。主要用于治疗对青霉素高度敏感的溶性链球菌，肺炎球菌，葡萄球菌引起的丹毒扁桃体炎，猩红热，产褥热等。主要对G+,G-球菌有强大的杀菌作用，但对G-杆菌，真菌及病毒无效。临床上用于治疗葡萄球菌传染症，如脑膜症、化脓症、骨髓症等，溶血性链球菌传染症，如腹膜炎、产褥热以及肺炎、淋病、炭疽等。青霉素中以G型和X型作用最强，G型对霉素有效，对葡萄球菌的作用也比X型强，X型对淋病、腹膜炎及肺炎则比G型有效。国内外生产现状和发展趋势抗微生物感染药物是当今全球医药市场中销售额居第二位的一大类药物，其中的青霉素类抗生素全球产销量最大。 随着全球医药工业技术水平的不断提高，青霉素的用途范围也得到了进一步扩大。目前，除了用于临床微生物感染的传统治疗外，其原料药经6APA、7ADCA及GCLE等中间体的转化后，被广泛应用于半合成青霉素和头孢类药物的生产。而这些由青霉素为原料的半合成