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文档简介

免疫组化步骤1、 烤片：放于60烘箱内，20-25min；2、 脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；3、 复水：100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精-50%酒精，5min/次；4、 ddH2O洗2次，5min/次；5、 抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS-0100），125，5min；注：1x修复液：198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀；抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close”对准白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；6、 修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次，5min/次；7、 去除 H202酶：3%H202，15min；注意遮光；注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml PBS 50ml 3%H202）8、 PBS 2次，PBST 1次，5min/次；9、 封闭（blocking）：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温1h，湿盒；封闭液不要过多，以免溢出；注：封闭液：1xPBS，0.3%Triton X-100，10% goat serum（如：870ulPBS+30ul 10% Triton X-100+100ul 10% goat serum 1ml封闭液）；10、 孵一抗：用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4，过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：GFAP-1:200，Ki67-1:200，CD31-1:201:40，Flag-1:200，Nestin-1:200，III-Tubulin-1:100011、 室温，30min；（从冰箱拿出时动作也要缓慢）12、 PBST洗3次，5min/次；注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10%Triton X-1000 ;13、 加荧光标记的二抗（封闭液稀释抗体1:1000），1h，室温，湿盒；加HRP标记的二抗（封闭液稀释抗体1:10000），室温30min; 注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；14、 PBST洗3次，5min/次；15、 若复染：DAPI染色，避光，5min；若TSA放大310min,PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；注：DAPI：50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍16、 封片：直接向组织滴加抗荧光淬灭剂，注意不要产生气泡，盖盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光45min后即可拍片
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