浅谈高效酶解技术.doc

浅谈高效酶解技术1. 高效酶解技术的认识1.1酶和酶法水解近年来，随着基因工程、发酵技术的进步、酶生产成本的不断降低和酶应用技术研究的不断深入，酶技术在食品工业中的应用越来越广，酶法水解产品（如酵母抽提物）逐渐走入人们的视线并实现产业化。在食品加工中，酶主要应用于回收副产品、改进食品风味、提高食品质量、研制开发新品种、提高提取速度和产品得率等。酶制剂在食品工业中属加工助剂类添加剂。在商品工具酶方面，主要的商品酶品种为中性蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶等，食品工业用酶的选择必须考虑几个原则，这些原则包括安全性、法规容许、成本、来源稳定性、纯度、专一性、催化反应能力以及在使用过程中保持稳定等。食品原料水解方式主要有化学水解和酶水解。化学水解是利用强酸强碱水解原料，虽然简单价廉，但存在反应条件剧烈，生产过程中敏感基团受损严重， 副反应多，且难以按规定的水解程度控制水解过程的问题。与化学水解相比较，酶法水解具有如下特点：(1)水解条件温和、对敏感基团无破坏作用；(2)能最大的保留原料的营养成分和风味；(3) 副反应少；(4) 水解程度容易控制。酶法水解的缺点在于：(1)酶制剂较为昂贵，生产成本较高；(2)酶解效率低，常规的水浴酶解需要几个小时，费时费力(3)水解程度相对较低；(4) 长时间深度酶解过程可能导致微生物孳生。常规酶法水解温度通常在4560之间，反应时间则从348 h不等，水解程度受酶的种类和活力、专一性、pH值、底物浓度、产物浓度、激活剂、抑制剂、水解温度、水解时间等诸多因素的影响。如何以较低的生产成本获得较高的水解度是生产酶法水解产品的难点。1.2 开发高效酶解技术目前提高酶解效率的途径包括：筛选培育高效酶种、多酶系的复合作用、优化酶解条件、预处理原料、固定化酶以及采用其它技术辅助酶解等。1.2.1筛选培育高效酶种自然界中酶的来源广泛，它可以来自动物、植物和微生物。迄今已发现的酶有5000余种，其中已经利用的有150种左右，工业化生产的酶约60余种，仅占已知酶的1.2，而大规模生产的只有20多种，主要是利用微生物通过发酵法生产的。自然界微生物资源丰富，从陆生、海洋到极端环境中都可以获得大量产酶微生物菌种，从而发现、研制和开发新酶种。再加上新科学、新技术的推广应用，如基因工程、蛋白质工程和定向进化技术以及其他各种高新技术等均可在新酶种开发中应用。特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。因此筛选培育高效酶种可从这两个方向出发：（1）继续从天然的微生物资源中去筛选，开发新的酶产品和产酶菌种；（2）要积极利用基因工程技术来提高、改造新的或现有的酶生产菌的生产性能。对于水解酶，筛选的指标一般是考察其水解度；另外，采用不同的酶类水解同一原料后，即便水解度接近，但由于各类酶的作用位点存在很大不同，导致其营养成分和风味成分等物质的组分差异。因此，还应采用其它方法（如HPLC）对酶解产生的物质组分种类和浓度进行分析和讨论。1.2.2多酶系的复合作用单一酶的水解反应较为简单，在反应一段时间后由于酶活力的降低，同时酶作用位点的消失使水解达到一个平台期，往往达不到水解要求。目前常用多酶系复合作用的方法以提高水解效率。最常见的多酶系复合水解仍然是两种以上酶混合同时在反应初始阶段加入反应系统中，底物同时被两种以上的酶水解，其水解效率往往有被提升的作用。但酶的混合使用必须考虑到各个酶之间不会影响对方才可，否则混合酶会相互抵消活性，同时不同酶的最适反应pH与温度也不可相差太多，例如胃蛋白酶的pH和温度与胰蛋白酶、Protamex TM复合蛋白酶相差较远，因而只有采用酶组合的方法，即先用酶作用一段时间后再改变条件添加其余的酶。但若实验结果没有明显差异，从操作的角度出发以混合使用较为简便易行。1.2.3优化酶解条件在确定使用的酶种类后，酶解条件往往成为水解度的重要因素。通过酶解条件的优化，才能最大程度发挥酶的作用效果。在优化酶解条件方面，主要的酶解参数包括加酶量、固液比、温度、pH值、时间等。一般来说，酶促反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系，曲线逐渐趋向平缓。另外，增加酶用量在一定程度上可以提高水解得率及速率，但同时会显著增加成本。在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加，其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。因此，应有一个合适的固液比。酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。因此酶解温度的选择也很重要，温度太低，不仅酶解速度慢，而且酶解液容易腐败变质；温度太高，酶容易失活导致水解度降低。酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在两个方面：（1）改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；（2）过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。时间对于酶解反应也很重要，时间太短，水解度太低；时间太长，不仅成本增加，而且酶解液同样易腐败变质。1.2.4预处理原料底物性质是影响酶法水解得率和初始速率的主要因素之一。因此，为了提高酶解效率，通常利用预处理来减少原料的结晶度和提高酶的可接近性。开发出成本低廉、简便高效的原料预处理技术可以大大加速酶解速率。有效的预处理方法主要有物理处理法、化学处理法和生物处理法。物理处理法包括微粉碎处理、蒸汽爆破法、微波和超声处理法等；化学处理法一般使用酸、碱、有机溶剂处理；生物处理法利用微生物部分降解原料中难酶解成分以利于酶与底物的接触，但该法处理时间较长。1.2.5固定化酶作为酶工程的一个重要分支，酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。通过酶的固定化技术，可以极大改善酶在热、强酸、强碱和有机溶剂等条件下不稳定的性质，可以增大酶对温度和pH的适应范围，降低酶对抑制剂的敏感性;使酶解反应条件容易控制;并且在反应结束后，很容易将酶与反应液分开，便于产品的分离和纯化;酶也可以多次使用，提高酶的使用效率;并且可实现批量或连续操作，适于产业化，连续化和自动化生产。保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。改善酶固定化效果的途径有:改善表面积以及孔径等物理结构，如采用分子筛或纳米纤维微孔膜;改善化学交联的反应及方式，如辐照，引发剂引发等;改善结合的方向选择性，如采用定向固定化的方法;其他手段，如利用长臂使酶远离载体表面，使载体-酶体系的溶解度随温度、pH值等条件的改变而改变，以便于产物的分离及酶的回收。针对不同的酶有不同的策略，对于某些酶可能取向很重要，而对于其他酶可能载体造成的环境重要一些，因此，每种酶固定的最佳条件目前还是特异的，没有统一的理论。近年来，还出现一些新型固定化载体，如磁性高分子微球。与非磁性材料相比，磁性高分子微球作为固定化酶的载体具有以下优点:有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，操作简便，对于双酶反应体系，当一种酶失活较快时，可以用磁性材料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本。磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作，利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。除了磁性高分子微球用于固定化酶的研究外，国内外许多研究人员还利用等离子体技术对一些力学强度较好，但缺少活性基团(如羟基、羧基、羰基、氨基等官能团)的材料进行处理，以得到更好的新型固定化酶载体。等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后可用于固定化胰蛋白酶;而等离子体引发丙烯酰胺聚合包埋固定化的葡萄糖氧化酶用于麦芽糖的酶促转化时，运转20天也未发现酶活性损失的现象，显示出优良的操作稳定性。目前，寻找适用的固定化方法，设计合成性能优异且可控的载体，应用工艺的优化研究等仍是研究热点。改进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋势，进一步提高转化率和生产能力，是未来研究的重点。1.2.6采用其它技术辅助酶解尽管通过高效酶种的筛选培育、多酶系的复合作用、酶解条件的优化和原料的预处理可在一定程度上提高酶解效率，但是人们仍在积极探索更高效率的酶解方法。近年来，出现了一些酶解辅助技术，可极大程度地缩短酶解时间，提高酶解效率。Lin等研究了以功能磁性纳米材料固定酶为基础的微波辅助快速酶解新方法。发展了一系列新的纳米磁性微球表面固定酶的简单方法，并利用纳米磁球高效吸收微波辐射能量的优点，将蛋白酶固定在合成好的纳米微球上，在微波辐射下，极大地提高了蛋白质酶解的效率。相比于传统的酶解方法，该酶解技术将蛋白酶解所需时间从12 h缩短至15 s，而且酶解效果优于传统的溶液酶解方法。Izquierdo等研究了高压及微波技术对链霉蛋白酶以及-胰凝乳蛋白酶酶解-乳球蛋白的作用，实验发现在微波条件为:微波功率30W(链霉蛋白酶酶解时)或15 W (-胰凝乳蛋白酶酶解时)，酶解反应均在40，1020 min内即完成，