《酶免疫技术》PPT课件.ppt

酶免疫技术及室内质量控制 EnzymeImmunoassayandqualitycontrol叶芸 免疫标记技术是用荧光素 放射性同位素 酶 铁蛋白 胶体金及化学 或生物 发光剂等作为追踪物 标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应荧光显微镜 射线测量仪 酶标检测仪 电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器 对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定敏感性 特异性 精确性及应用范围 免疫荧光技术放射免疫技术免疫酶技术免疫电镜技术免疫胶体金技术发光免疫测定 抗原抗体反应 酶催化反应肉眼 光学显微镜 电子显微镜 分光光度计特异 敏感可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位 或在微克 甚至纳克水平上对其进行定量 酶免疫技术EnzymeImmunoassay EIA 一 概述 酶免疫标记用于抗原检测 一 基本原理 酶标记抗体或抗原 抗体或抗原的免疫学反应特异性 酶活性酶是一种有机催化剂 使底物基质水解而呈色使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 可用呈色反应显示酶的存在 很少量的酶即可导致大量的催化过程 所以极为敏感 二 常用的酶及其底物 酶活性高 具有抗原抗体共价结合的基团 标记后不影响酶活性及抗原 抗体反应性 产物易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活 无害 稳定 价廉 易得 常用酶底物显色辣根过氧化物酶邻苯二胺 H2O2橙黄色四甲基联苯胺 H2O2蓝色碱性磷酸酶对硝基本磷酸脂黄色 三 标记方法 酶结合物技术简单 产率高 不影响酶和抗体 抗原 的生物活性 所得酶标记物稳定 较少形成酶与酶 抗体与抗体 抗原与抗原的聚合物 四 酶标记物的纯化及鉴定 1 纯化葡聚糖凝胶层析法50 饱和硫酸铵沉淀提纯法 2 鉴定免疫活性鉴定 免疫电泳 ELISA 五 固相酶免疫测定仪 酶标仪 比色测定波长 吸光度范围 光学系统 检测速度 震板功能 温度控制 定性和定量的软件 自动洗板 温育 加样450nm 492nm 620nm 630nm 650nm 405nm 六 类型 酶免疫组织化学技术 酶免疫测定 均相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 高敏感 高特异 几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测 酶 免疫组织化学 免疫细胞化学 指带显色剂 酶 标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应 对相应抗原或抗体进行定性 定位 定量测定的技术 免疫反应特异性组织化学的可见性 二 酶免疫组织化学技术EnzymeImmunohistochemistryTechnique EIHCT 免疫组化技术近年来得到迅速发展 50年代还仅限于荧光免疫组化技术 50年代以后逐渐发展建立起高度敏感 且更为实用的酶免疫组化技术 荧光免疫组化技术局限性 荧光抗体染色标本不能长期保存 对组织细胞的细微结构分辨不清酶免疫组化技术 能克服上述不足 且敏感性更高 对石蜡切片标本尤为适用 酶显色产物具有较高的电子密度 可用电镜观察 步骤 抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合 制备特异性抗体及纯化标记抗体标本处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜观察 三 酶联免疫分析技术Enzyme LinkedImmunosorbentAssay ELISA 1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn 荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法 称为酶联免疫吸附试验 简便 快速 敏感 特异 实验设备简单 应用范围广 无同位素污染 一 基本原理 酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术 先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应加入酶标抗体与免疫复合物结合 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分最后加入酶反应底物 根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度 A 值的大小进行定性或定量分析的方法 根据检测目的和操作步骤不同 双抗体夹心法间接法竞争法捕获法dot ELISABAS ELISA 二 类型 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原 适用于多价大分子抗原的检测 而不能用于测定半抗原等小分子物质 双抗体夹心法 间接法 此法是测定抗体最常用的方法 间接法 竟争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定 也可用于测定抗体 此法用于血清中某种抗体亚型成分测定 以IgM测定为例 捕获法 抗人IgM 链抗体 样本 IgM1 2 抗人IgM 链抗体 IgM1 特异抗原 Ag1 抗人IgM 链抗体 抗人IgM 链抗体 IgM2 抗人IgM 链抗体 IgM1 抗人IgM 链抗体 IgM2 Ag1 Ab1 E 抗人IgM 链抗体 IgM1 抗人IgM 链抗体 IgM2 Ag1 Ab1 E 三 技术要点 1固相载体 与Ab或Ag有较高结合容量 结合稳定 可结合AgAb及亲和素或链酶素等大分子蛋白 生物大分子固化后应保持活性 活性基团朝向反应溶液 固相化方法简便快速经济 塑料 非共价或物理吸附 小试管 小珠 板条微颗粒 化学耦联 结合容量大 均匀分散在液体中 反应快 可磁化 方便分离 膜载体 硝酸纤维素膜 玻璃纤维素膜 尼龙膜 非共价结合 吸附力强 2免疫吸附剂指与固相载体结合的Ag或Ab 将Ag或Ab固相化的过程称包被 coating 用1 5 牛血清白蛋白或5 20 小牛血清等结合包被后固相载体表面剩余的少量未吸附位点 为封闭 blocking 斑点 酶联免疫吸附试验 dot ELISA 原理 似ELISA 但载体为硝酸纤维素 NC 膜 更灵敏 节约 简便 易保存 斑点 酶免疫渗滤试验ImmunofiltrationAssay IFA 原理 以NC膜为载体 利用微孔滤膜的可滤过性 使抗原抗体反应和洗涤在一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成 以胶体金为标记物的金免疫渗滤试验省却了酶对底物的反应 更加简便快速 以双抗体夹心法HCG为例 标本中HCG与NC膜上抗 HCG结合 再加胶体金标记的抗 HCG抗体 形成双抗体夹心复合物 红色 原理 滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动 移动过程中待测物与固定于膜上某区域的抗原或抗体结合而被固相化 通过标记物染色 免疫层析试验ImmunochromatographyAssay ICA 免疫印迹技术ImmunoblottingTest IBT 又称蛋白质印迹 Westernblotting 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 蛋白转运 酶免疫技术将含有目标蛋白 抗原 的样品 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 或非变性电泳 Native PAGE 等分离 转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面 将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测 生物素与亲和素系统酶联免疫吸附试验Biotin AvidinSystemELISA BAS ELISA 生物素 亲和素系统 biotin avidinsystem BAS 是70年代后期应用于免疫学 并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统 多级放大效应 灵敏生物素与亲和素之间高度亲和力 特异稳定适用性强 与荧光素 酶 同位素等免疫标记技术有机地结合 3 26 2020 ELISA试剂的选用和质检 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素试剂盒的选用试剂盒的质检方法目前试剂盒存在的问题 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素 1 原材料 1 固相材料商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板 其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异 2 抗原 自然抗原 合成抗原和基因重组抗原 纯度 纯度不高可致试剂盒的特异性不强 立体结构 合成抗原一般都是多肽抗原 缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇 可能导致结合上述决定簇的抗体漏检 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素 3 抗体多克隆抗体 多抗 制备简单 含针对抗原的多种决定簇 但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗 且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别 单克隆抗体 单抗 可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体 缺点是结合的单一性 当建立双抗夹心ELISA测定方法时 如包被和指示抗体使用同一单抗 则由于结合位点的缺乏 很容易造成假阴性结果 尤其是在使用一步法时 钩状 效应 Hookeffect 的出现 因此 在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时 包被抗体可为混合单抗 从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素 4 酶结合物ELISA试剂盒的核心部分 通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的 辣根过氧化物酶 HRP 易于提取 价格相对低廉 性质稳定 耐热及有机溶剂的作用 与抗原或抗体偶联后 活性很少受损失 碱性磷酸酶 ALP 碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素 5 色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺 OPD 和四甲基联苯胺 TMB 邻苯二胺 OPD OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一 当pH值降为1 0时 最大吸收波长为492nm 显色加深 因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应 OPD的缺点是其对机体具有致突变作用 四甲基联苯胺 TMB 氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数 试剂盒中常为已配好的A B两种液态试剂 即一定浓度双氧水溶液和TMB 它们在溶液中相对不稳定 因此在使用ELISA试剂盒时 如底物A 或 和B出现颜色 或各取一滴混合后显色 说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染 必须废弃 3 26 2020 影响试剂盒质量的因素 3 试剂盒的运输和贮存ELISA试剂盒的效期一般为6个月 这是指在贮存温度为2 8 C的情况下 但一个试剂盒从出厂至用户手中 均要经历运输 如送检 检定 发货等 及运输中的贮存 某一环节的不当 均会影响试剂盒的临床使用质量 3 26 2020 试剂盒的选用 1 根据可能影响试剂盒质量的因素 从以下几个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求效期固相材料的来源包被抗体或抗原的性质 单抗 多抗或合成多肽或重组多肽 显色底物 是TMB还是OPD 测定模式 一步法或二步法 3 26 2020 试剂盒的选用 2 同行对有关试剂盒的使用效果个别的使用效果在实际工作中 其它实验室对某种试剂盒的实际使用效果 往往具有很强的说服力 综合的使用评价对一种试剂盒的综合使用评价 是指多个实验室对这种试盒实际应用效果的综合分析 3 26 2020 ELISA试剂盒的质检 1 包装 储存状态内外包装 效期 试剂瓶是否漏液 真空包装是否破损 试剂是否齐全等等2 采用血清盘 panel 质检血清盘由一定数量的阴 阳性样本组成 可用来判断试剂盒的灵敏度 特异性和符合率 如HBsAg 抗HCV和抗HIV等血清盘 3 26 2020 ELISA试剂盒的质检 实验室质量控制的问题及分析 一 检测系统的问题1 取样工作是前题 样品应具有一定的代表性 如果样本采集过程出现问题 在以后的实验过程是无论如何也不能控制的 取样的质控关键是要注意样本的数量及样本的均匀性和稳定性 2 分析方法及测试手段的可靠性 可靠性取决于检验人员自身业务技术水平 实验室仪器设备的灵敏度 精确度 实验方法的可靠性 正确性 因此说数据的真实性可及可靠性取决于分析技术 3 移液器 1年至少标定一次 4 试剂平衡 在实验开始前 将试剂盒先从冰箱中拿出来 在室温下放置30分钟以上后 再进行测定 实验室质量控制的问题及分析 5 关于温育 在实际测定操作中一定要保证在设定的温度下有足够的反应时间 一般来说 加完样本和 或反应试剂后 将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时 孔内温度从室温升至37 C 需要一定的时间 尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下 这段升温时问可能还比较长 而在实验室中 很少有人注意这个问题 通常是将微孔板一放入温箱即开始计时 这样就很容易造成实际测定中温育时间不够 弱阳性样本测不出来的问题 即尽量采用水浴 温育中让微孔板浮于水面上 或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒 放于温箱中 这样就会因为板条孔底部直接与37 2水或湿布的接触 以及水浴箱或湿盒内的高温度 而使反应溶液的温度迅速与温室平衡 HIV筛查实验室质量控制的问题及分析 6 洗板的问题 对于ELISA测定来说 洗板也是极其关键的一步 洗板时因注意非离子去垢剂的使用浓度 洗板液中Tween20浓度高于O 2 可使包被子固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限 同时还应注意洗板机洗板至彻底所需的次数 洗板机液体残留量大小 大量样本检测时 机器洗板比手工洗板结果更趋稳定 系统变异小 实验室质量控制的问题及分析 7 单波长或双波长比色的选择单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450hm或492nm进行比色测定 而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次l如在使用双波长比色时 一般不必设空白孔 仍设空白孔 就可能会造成测定孔吸光度为负数的现象 由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性 也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值 故而在ELISA测定比色时 最好是使用双波长比色 实验室质量控制的问题及分析 二 统计学质量控制1 系统误差 通常表现为质控物测定均值的漂移 多由操作者所使用的仪器设备 试剂 标准品出现问题而造成 这种误差可通过SOP 人员培训等测定前措施加以控制和排除 2 随机误差 通常表现为测定SD的增大 主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致 这种误差难以完全避免和控制 统计学质控的功能 就是发现误差的产生及分析误差产生的原因 采取措施予以避免 实验室质量控制的问题及分析 三 统计学质控的方法 1 基线测定 连续测定同一浓度同一批号质控物20批次以上 最佳条件 仪器 试剂 操作者 下的变异 OCV 和常规条件下的变异 RCV 当RCV与OCV接近 或小于2OCV时 RCV是可以接受的 2 Levey Jennings质控图方法 根据RCV计算中的均值X和SD确定质控限 一般以X 2SD为告警限 X 3SD为失控限 其统计学含义为 在稳定条件下 在20个IQC结果中不应有多余一个结果超过2S 95 5 可信限 限度 在1000个测定结果中超过3S 99 7 可信限 的结果不多于3个 因此如以X 3SD为失控限 假失控的概率为0 3 此概率低 提示误差检出能力不强 如以X 2SD为失控限 假失控的概率太高 通常不能接受 3 即刻法 质控方法 将连续的质控测定值从小到大排列后并计算均值X和标准差S 带入公式计算SI上限和SI下限 再与 即刻法 质控SI值表比较 确定质控测定值的变化范围 如在2S之内是可以接受的 在2S 3S之间则处于告警 大于3S则属失控 可以利用Excel电子表格强大的数据处理功能 制作出多规则室内质控图表 可对室内质控数据进行处理 并能实时判断是否失控 大大方便了实验室室内质控数据的管理 实验室质量控制的问题及分析 HIV酶免实验室质量控制过程 环境 仪器 试剂 操作步骤 均有文件和SOP可以控制 最为重要的样本收集和处理往往问题较多 易受多种因素影响 导致测定结果偏移或失准 可能影响测定结果的标本因素包括 一 内源型干扰因素