心脏生物起搏

心脏生物起搏,郭继鸿 教授北京大学人民医院心电生理室,心脏生物起搏的重要性心脏生物起搏的要求心脏生物起搏的研究基础国外研究动态本课题组的研究进展仍需解决的关键问题,心脏生物起搏的重要性,心脏传导功能障碍导致缓慢性心律失常，最常见的是房室传导阻滞和病态窦房结综合征.病理基础： 起搏和传导的心肌细胞功能受损、数量减少。目前的治疗手段： 植入永久性起搏器.,电子起搏器在临床应用中的局限性不能替代自主神经系统对心率的调控。与心脏生理性传导顺序有差异电池耗竭需定时更换与手术和起搏器有关的并发症易受外界电场和磁场的干扰儿童患者,心脏生物起搏的重要性,2003年美国哥伦比亚大学Rosen教授正式提出心脏生物起搏（biological pacemaker）的概念。,为解决电子起搏器的局限性：,应用基因治疗和（或）干细胞技术构建心脏起搏点，替代受损的心脏传导系统，为缓慢性心律失常的治疗提供新的手段。,心脏生物起搏的要求,长期、稳定的提供心脏起搏点无需定时更换能够有效治疗缓慢性心律失常性疾病无严重的免疫及炎症反应无致瘤作用能接受自主神经系统的调控符合生理性传导顺序不会诱发新的心律失常,心脏生物起搏的研究基础,心脏起搏分子机制干细胞向心肌细胞诱导分化基因治疗技术在心血管疾病的应用,心脏起搏的分子机制,起搏电流（If）延迟整流性钾电流（Ik）内向钙电流（ICa）Na+-Ca2+交换电流（INa-Ca）持续性钠电流（Ist）,参与心肌细胞动作电位4相自动除极的离子电流包括：,动作电位4相除极早期的主要电流,介导起搏电流的离子通道为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）。目前已克隆4种HCN通道基因亚型，分别命名为HCN1-HCN4。,HCN通道的分子结构,干细胞向心肌细胞诱导分化,1999年Makino S（ J Clin Invest ）体外诱导间充质干细胞分化为心肌前体细胞，细胞自主跳动，并记录到慢反应细胞和快反应细胞的动作电位。,成体干细胞,胚胎干细胞体外诱导向心肌细胞分化，自发搏动的细胞可以检测到类似窦房结、心房肌、心室肌细胞的动作电位。（Circ Res. 2003）。,干细胞向心肌细胞诱导分化,胚胎干细胞,细胞因子，如内皮素-1可以促进胚胎干细胞体外向自律性细胞的分化（ FASEB，2004）,窦房结样细胞,心房样细胞,国外研究动态,基因治疗,国外研究动态,1.提高心脏自身的起搏频率 Edeberg等于1998年（J Clin Invest）和2001年（Heart）将人肾上腺素2受体的基因转染到小鼠和猪的心脏（右心房），明显提高心脏自身起搏频率。,对照,转染,国外研究动态,2.通过抑制心肌细胞内向整流钾电流 Miakel等于2002年（Nature）通过基因突变技术和腺病毒载体，抑制心室肌细胞的内向整流钾通道功能，结果出现心室异位节律，频率接近窦性节律。,国外研究动态,3.提高起搏电流（If）通道基因的表达 HCN2基因重组腺病毒注射狗的左心房（Circulation. 2003)或左束支（Circulation. 2004），刺激迷走神经抑制窦房结和房室结后，出现源于注射部位的频率较高的异位节律。,左束支,对照,转染,单用基因治疗存在的问题,病毒载体:毒副作用和免疫反应基因表达:时间有限、难以调控动物实验：时间短，缺乏安全性评价,国外研究动态,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按照生存阶段可分为成体干细胞和胚胎干细胞。理论上应用干细胞进行心脏生物起搏有两种方式：,干细胞治疗,胚胎干细胞体外分化为心肌细胞后移植（Xue et al, Circulation 2005）起搏通道基因HCN2修饰间充质干细胞后移植（Potapova、Qu et al Circulation 2004）,国外研究动态,干细胞治疗,两种干细胞在心脏生物起搏研究中的比较,国外研究动态,目前可行的心脏生物起搏的策略,基因治疗间充质干细胞,即将间充质干细胞作为载体细胞，对间充质干细胞进行基因修饰，使其具有心脏自律性细胞的功能，然后移植到心脏，以替代受损的心脏传导系统。,优点：既显著减少病毒载体的毒副作用，又能发挥间充质干细胞独特的优势。,本课题组的研究进展,通过HCN4通道基因修饰间充质干细胞，使其具有起搏电流的功能，为缓慢性心律失常的治疗提供新的手段。,研究目的,起搏通道基因修饰间充质干细胞进行心脏生物起搏,缝隙连接Gap Junction,心肌细胞,干细胞,HCN通道,起搏电流If,动作电位AP,主要研究内容,目前主要研究结果,1、成功构建HCN4通道基因的重组腺病毒载体，图例为原代重组腺病毒的包装过程。,目前主要研究结果,2、重组腺病毒能高效介导报告基因绿色荧光蛋白在细胞中的表达，基因转染效率超过90,目前主要研究结果,A: 绿色荧光蛋白的表达B: 罗丹明（红色）抗体标记HCN4蛋白的表达C: A图和B图的图像叠加,3、重组腺病毒高效介导HCN4通道在cos-7细胞中的表达,目前主要研究结果,转HCN4通道基因细胞的起搏电流,4、膜片钳实验表明，转染到COS-7细胞中的HCN4通道能够发挥介导起搏电流的功能。,目前主要研究结果,特异性阻断剂Cs+（2 mmol/L），能够阻断绝大部分的电流，进一步证实为起搏电流。,Cs+对HCN4通道的阻断作用,目前主要研究结果,5、重组腺病毒能高效转染培养的乳鼠心肌细胞,目前主要研究结果,细胞免疫荧光检测心肌细胞HCN4通道蛋白的表达 (400) A:感染后心肌细胞绿色荧光蛋白的表达 B:罗丹明标记（红色）HCN4蛋白的表达 C:对照组心肌细胞,6、细胞免疫荧光结果表明，重组腺病毒载体能高效介导HCN4通道在心肌细胞中的表达。,目前主要研究结果,HCN4基因转染到心肌细胞后，能明显提高心肌细胞自发搏动的频率自发搏动节律比对照组心肌细胞规整.,7、电生理研究结果表明：,目前主要研究结果,8、膜片钳实验表明：动作电位时限(CL)较对照组细胞明显缩短 最大舒张电位(MDP)向去极化方向偏移 动作电位出现4相自动除极（SP4）,CL缩短,A：对照组 B：病毒感染组,目前主要研究结果,转HCN4通道基因心肌细胞的起搏电流,对照组心肌细胞的起搏电流,病毒感染的心肌细胞起搏电流检出阳性率和电流幅度也明显高于对照组。,目前主要研究结果,9、重组腺病毒载体高效转染骨髓间充质干细胞,10、细胞免疫荧光证实转基因骨髓间充质干细胞中HCN4通道的表达。,转基因骨髓间充质干细胞HCN4通道蛋白的表达（400） A:骨髓间充质干细胞中报告基因绿色荧光蛋白的表达 B:骨髓间充质干细胞中HCN4通道蛋白的表达 C:A和B图像叠加,目前主要研究结果,Cs+对骨髓间充质干细胞起搏电流的阻断作用,转HCN4通道基因骨髓间充质干细胞的起搏电流,腺病毒感染的细胞中，约65可以检测到起搏电流。而对照组细胞未检测到类似电流。 Cs+能够特异性阻断约90的电流，证实记录到的电流为起搏电流。,11、干细胞电生理研究表明：,研究结论,HCN4腺病毒载体构建成功，为深入研究起搏通道的电生理功能和基因治疗缓慢性心律失常疾病提供了有效的工具。提高HCN4基因的表达能明显增强心肌细胞的自律性，证实HCN4基因可作为心脏生物起搏的备选基因。腺病毒载体高效介导了HCN4通道在间充质干细胞中的表达,证实充质干细胞可作为心脏生物起搏的载体细胞。,目前正在进行的研究,用HCN4基因修饰的干细胞在动物模型体内移植，已初步证实其有效性。观察转染HCN4基因对胚胎干细胞电生理特性的影响。,仍需解决的关键问题,心脏生物起搏的频率应答能够符合人的生理需要。 增加基因表达的时间，使之在有效性和耐久性上达到与电子起搏器相同甚至更好