Northern blot技术.doc

核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二（一）Southern Blot 原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法 northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。 Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。 流程首先需要从组织或细胞中提取总RNA ,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RNA降解。RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。Northern blot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过的无表达的基因。 材料电泳胶Northernblot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛可以减少RNA的二级结构，电泳完成后的胶可经过EB染色后在紫外下检测RNA的质量。而对小分子的RNA 或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺变性胶电泳。RNA电泳中可以依据核糖体RNA的大小大致判断条带的大小，28S RNA大小一般为5kp，18S RNA 大小一般为2k。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。 探针Norther blot中探针的序列需要和检测目的基因序列互补配对，探针可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的长度必须大于25bp，体外合成的RNA探针可以采用更高的退火温度来减少背景中的噪音。探针一般采用P或者地高辛来进行标记。杂交过后，可采用X胶片显色的方法来检测信号。 应用Northern blot 可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。如northern blot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northern blot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。 优缺点分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除northern blot 外还有RT-PCR、基因芯片、RNA酶保护实验等。基因芯片常和northern blot一起使用，但通常情况下，northernblot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot显然要逊色不少，但northern blot较高的特异性可以有效的减少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以northern blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，norther blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。 Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率(Miller，1987)，但用含朋乙二醛DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。1)在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛 5.4lDMSO 16.0l0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0l RNA(多达10l) 5.4l市售乙二醛通常为40溶液(6mol/L)。 由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂(Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份， 用盖紧的小管贮存于20。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠(pH7. 0)的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10g RNA，通常用10- 20 g 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1以上)，如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0g poly(A)+RNA。2)将微量离心管盖严，将RNA溶液置于0温育50温育60分钟后， 用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。3)于50温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品， 而用1琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。 用0mmol/L 磷酸钠(pH7. 0 )后， 降温至70 ， 加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L(使RNA酶失活)，再降温至50，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。4)将RNA样品冷却至0，加入4l 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。乙二醛DMSO凝胶加样缓冲液50甘油10mmol/L磷酸钠(pH7.0)0.25溴酚蓝0.25二甲苯青FF5)将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以34V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度 内(pH8.0时乙二醛将从PNA分子上解离)。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。6)电泳结束后(溴酚蓝迁移出区8cm)，切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液(0.5g/ml， 用0.1mol/L乙酸铵配制)中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。7)RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必(Thomas，1980)甚至有害(Thomas，1983)， 但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大于1或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。1)将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。2)用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。3)用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜(Schleicher Schuell BA85或与之相当的产品)。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm， 接触滤膜时须戴手套或用平头镊子(例如Millipore镊子)，用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。4)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角， 使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间， 高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋， 密封后于4保存备用。5)将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。6)用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶， 以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。7)在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。8)用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸， 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。9)切一叠(58cm高)略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。10)使上述RNA转移持续进行618小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。11)转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。12)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率， 可将胶置于溴化乙锭溶液(0. 5 g/ml ， 以0.1mol/L乙酸铵配制)中染色45分钟，于紫外灯下观察。13)将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80干烤0.5-2 小时。如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。14)仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。(三)转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的染色当自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的的优点。方法)电泳结束后，含乙二醛的凝胶应浸入含溴化乙锭(0.5 g/ml)的10mmol/L磷酸钠(pH7.0)溶液。甲醛凝胶需用无酶的水淋洗，用20x溶液浸泡，随后用含溴化乙锭(0.5g/ml)的20x溶液染色。)于室温染色分钟，在紫外灯下观察，照像。)按前所述方法， 将凝胶中的转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在光下也可看出已染色的条带。这种方法仅适用于每一泳道