第三章 遗传多样性保护2.ppt

遗传多样性保护 第三章 第一节常用分子标记技术 一 聚合酶链式反应 1 pcr技术的工作原理 该技术是在模板dna 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下 依赖于dna聚合酶的酶促合成反应 dna聚合酶以单链dna为模板 借助一小段双链dna来启动合成 通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链dna模板中的一段互补序列结合 形成部分双链 在适宜的温度和环境下 dna聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3 oh末端 并以此为起始点 沿模板5 3 方向延伸 合成一条新的dna互补链 3 pcr技术的基本操作步骤 2 pcr技术的反应体系 模板dna 待扩增dna 引物 4种脱氧核苷酸 dntps dna聚合酶和适宜的缓冲液 变性 退火 延伸 模板dna的高温变性 模板dna经加热至93 左右 成为单链 模板dna与引物的低温退火 复性 温度降至55 左右 引物与模板dna单链的互补序列配对结合 引物的适温延伸 dna模板 引物结合物在taqdna聚合酶的作用下 以dntp为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链 二 线粒体dna 16 5kb左右 36 37个基因左右12srrna 16srrna 22trna 其他 控制区 d loop非编码区在进化过程中受环境的选择小 遗传变异大 进化速率高 广泛用于动物的遗传多样性和系统进化等研究 尤其是种内的遗传结构研究 对我国13个家驴品种367条序列的mtdnad loop区399bp进行分析 结果表明我国家驴的遗传多态性丰富 与3个努比亚野驴 3个索马里野驴和6个亚洲野驴的序列构建nj系统发育树 证明我国家驴的母系起源为非洲野驴中的索马里驴和努比亚驴 亚洲野驴不是中国家驴的母系祖先 12srdna 16srdna非常保守 用来解决高阶元和中间阶元的分类地位 细胞色素b基因的进化速度适中 一个较小的基因片段就能包含着从中间乃至科间的进化遗传信息 在系统进化和分类研究上有较强的实用性 dna微阵俗称基因芯片 genechip 将不同的dna或rna与点在固相支持物上的同一探针进行杂交 通过比较两个阵列所有对应点的杂交信号的强度 可以同时检测数千个基因表达的改变 二 dna微阵列 dnamicroarrays dna或rna的制备 rt pcr扩增 荧光标记 dna微阵列涂层的特殊玻璃片 杂交 荧光检测 数据分析 应用 耳聋基因芯片筛查大多数遗传性耳聋属于单基因病 gjb2 slc26a4 线粒体基因是导致中国大部分非综合征性遗传性耳聋的3个最常见的致病基因 通过对以上基因进行检测 可以诊断近80 的遗传性耳聋 2009年 世界上第一个遗传性耳聋基因检测芯片被研制出来 为耳聋残疾从干预救助向预防减残的迈进提供了切实可行的工具 在真核生物基因组中 存在一种短的串联重复序列拷贝构成的较大的序列簇 由于其重复序列很短 又被称为简单重复序列 ssr 个体基因组ssr存在着差异 这可用来清楚地研究个体间的遗传关系 ssr一般位于异染色质区 其中dna指纹技术也是基于ssr发展起来的 基因定位及克隆 疾病诊断 亲缘分析 品种鉴定 农作物育种 进化研究 三 ssr微卫星标记 提取dnapcr扩增电泳及显色电泳胶板带型的照相 记录数据分析处理 步骤 龙血树 百合科植物 生长十分缓慢 几百年才能长成一棵树 一百年才开一次花 寿命长达8000年 龙血树受伤后会流出 种血色的液体 这种液体是一种树脂 暗红色 是 种名贵的中药 国家二级濒危保护植物近年来 人类受经济利益的驱使 对柬埔寨龙血树进行大量的采集和砍伐 加之其自然更新能力差 且产区植被不断受破坏 其生存受到严重威胁 濒于灭绝 已列入 中国植物红皮书 稀有濒危植物 中 中科院西双版纳热带植物园植物系统发育与保护生物学研究课题组 从柬埔寨龙血树中成功开发了16对多态性高 扩增条带清晰且稳定的ssr引物 遗传多样性研究 可从分子水平上认识其遗传变异 适应性和生态环境之间的关系 探讨其遗传多样性与其濒危的关系 揭示致濒的机制和保护原理 为该濒危物种种质资源的综合保育策略的制定与实施提出科学的取样策略和理论基础 rflp标记是发展最早的dna标记技术 rflp是指基因型之间限制性片段长度的差异 这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入 缺失 重排或点突变所引起的 四 rflp限制性片段长度多态性 dna提取 用限制性内切酶酶切dna 用凝胶电泳分开dna片段 把dna片段转移到滤膜上 利用放射性标记的探针杂交显示特定的dna片段 southern杂交 和结果分析 油菜内生细菌16srdna的rflp分析 采用细菌16srdna的通用引物进行pcr扩增 结果得到1500bp左右的产物 分别用haeiii和mspi进行酶切 结果 软件进行相似性分析后 122株内生细菌在100 相似水平上被聚类分为39个类群 在70 的相似水平上被聚类分为27个类群 表明油菜内生细菌存在丰富的多样性 1990年发明并发展起来的 以基因组dna为模板随机引物dna聚合酶 taq酶 进行pcr扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离eb染色在紫外透视仪上检测多态性 五 rapd随机扩增长度多态性 扩增产物的多态性反映了基因组的多态性 rapd技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定 系谱分析及进化关系的研究上 山红树 红树科常绿乔木 中国只此一种 云南特产 国家三级保护植物 濒危物种山红树居群遗传结构的rapd分析 结果 10个引物共检测到54个位点 其中多态位点11个 占20 37 与其他的濒危物种相比 山红树居群内的遗传多样性很低 居群间的遗传分化很大 78 65 大量经济植物的种植加上人为的破坏 使山红树的生境遭到严重破坏 数量大为减少 可能导致了山红树遗传多样性的丧失 居群间较高的遗传分化 rapd技术的优点 可以在完全不知道分子生物学背景的情况下对基因组进行分析 检测速度快dna用量少随机引物可产生区分物种间 物种内 种群间或种群内个体的特异性条带 是指在基因组上单个核苷酸的变异 形成的遗传标记 其数量很多 多态性丰富 指在基因组上单个核苷酸的变异 包括置换 颠换 缺失和插入 它是人类可遗传变异中最常见的一种 六 snp 单核苷酸多态性标记 snp可帮助区分两个个体遗传物质的差异 被认为是应用前景最好的遗传标记 在人类基因组中 平均每1 3kb就有一个snp存在 目前已有2000多个标记定位于人类染色体上 在拟南芥也发展出236个snp标记 是继ssr和rflp之后的第三代分子遗传标记 粮食饲料药用 自然中澳两国的科学家通过对44株不同来源的高粱样本 包括地方品种 改良品种和野生杂草材料 进行了全基因组重测序及分析 并首次对拟高粱进行了全基因组测序 研究发现 高粱与拟高粱都存在丰富的遗传多样性 对高质量的单核苷酸多态性 snp 进行了鉴定分析 发现约83 的snp分布在基因间区 而编码区相对较为保守 这些遗传变异的发现 为高粱的改良和驯化提供了重要的科研依据 高粱 第二节分子保护生物学的应用实例 保护生物学最核心的内容是物种保护 栖息地保护 迁地保护 回归引种 用生态学的原理尽可能地维持物种的进化潜力 遗传学理论在濒危物种的保护中意义重大 物种鉴定 确定保护地点 种群管理 回归引种的种源选择 管理单元的确定 法医学的鉴定 一 分子系统学在保护中的应用 一 物种鉴定 过去 形态特征 化石记录现在 分子生物学技术相似形态的物种分类 分子标记技术 麋鹿 四不象 头脸像马 角像鹿 颈像骆驼 尾像驴 鹿科 世界珍稀动物 中国麋鹿和印度麋鹿外形非常相似 但是 中国麋鹿的染色体数为46 而印度麋鹿的染色体数为6或7 因此为不同的物种 口袋地鼠 美国 澳大利亚的口袋地鼠在20世纪60年代调查时只有不到100个个体 因此被列为濒危物种 但是 从等位酶 染色体和mtdna证据都表明其与附近东南部的种群没有明显差异 因此不能单独列为新种 从而为物种保护提供了依据 遗传距离 衡量品种间若干性状综合遗传差异大小的指标 按多元统计分析方法计算品种间多个性状基因型值构成的多维空间的几何距离 就叫作品种间的遗传距离 d为x和y两个群体的遗传距离 xij和yij分别表示x和y群体第j基因座上的第i等位基因的频率 r为基因座数 基于遗传距离构建的系统发生树能够反映种间的进化关系 因此常被应用与种间或种内分类地位的研究 线粒体细胞色素b基因的全序列作为遗传标记 发现两亚种之间的遗传距离远远大于种间的遗传距离 因此 认定这两个亚种应为两个独立种 分别为红喉姬和红胸姬 红喉姬鹟 雀形目 鹟科 姬鹟属 分为普通亚种和指名亚种 二 优先保护的物种或者种群 优先保护的地区 种群和亚种群的确定选择具有较高遗传多样性的种群和生境来优先保护 牡蛎香港养殖业支柱产业 上世纪末其种质资源严重衰退 等位酶 遗传标记 研究牡蛎各种群的遗传多样性港岛东部鹤嘴海洋保护区的种群遗传多样性高 且是牡蛎的重要迁出源 鹤嘴种群可以作为一个重点保护种群 进化显著单元 esu 如果有两个独立的类群 在mtdna上是单系群 在核基因位点上的频率发生了选族的分化 就可以认为这两个独立类群分别是两个不同的esu 具有优先单独管理价值 管理单元 mu 只要两个类群的等位基因频率发生显著分化 不管mtdna或者核基因的等位基因有没有发生系统分化 就认为这两个类群分属于不同的mu 对于一些遗传多样性程度不够高 但是含有特有的等位基因或者已经发生遗传分化的种群来说 我们也需要加以关注 海南坡鹿的保护坡鹿在东南亚大陆有三个亚种 海南亚种 泰国亚种 缅甸亚种 2003年 有国际学者提出要将海南亚种引入泰国 恢复其野生种群 对此 我国学者用线粒体分子标记比较了三个亚种的差异 序列比较和系统发生树的构建表明海南亚种和泰国亚种的进化关系比较近 但是已经发生了一定程度上的遗传分化 海南坡鹿的遗传多样性很低 所以 海南亚种和泰国亚种应该作为两个独立的esu进行管理 从而不支持泰国原分布区的重建计划 秦岭大熊猫种群的鉴定我国大熊猫分布于陕西 甘肃和四川三省交界的秦岭 岷山 邛崃 凉山 大相岭和小相岭等六个山系 dna指纹图谱 揭示了大熊猫六个山系具有包括早期隔离 中期分化和近期遗传退化等三种不同的分化模式 大约1万年前的冰川作用 导致了秦岭种群和其他种群在dna指纹图和形态特征两方面 均出现了显著差异 基于这两方面的显著差异 秦岭亚种应作为一个单独的管理单元予以管理 水稻籼粳亚种籼米粒直链淀粉含量较高 胶稠度硬 故蒸煮的米饭不粘 粳米谷粒较短圆 粘性较强 胀性小 中国水稻研究所应用70个ssr微卫星标记分析了3个籼稻测验种和3个粳稻测验种的多态性 发现其中36个标记可以区分籼粳测验种 再以18个籼粳品种进一步筛选 找到了分布于12条染色体的21个籼粳特异性微卫星标记 在这21个标记中 20个在籼粳亚种间带型相异 其中7个在亚种内带型一致 13个在亚种内带型不一致 1个标记在12个籼稻品种和1个粳稻品种检测到相同的带型 其余11个粳稻品种具有另一种带型 微卫星标记和rflp标记检测籼粳亚种不仅具有一致性 而且还有互补性 三 中间杂交对物种的影响 利用分子遗传学技术 我们还可以检测到杂交个体 在过去超过16年的时间里 中国有13个新的海龟种发布 大多数是基于香港动物交易场的标本来鉴定 野生种群未能找到 其中拟水龟和闭壳龟的分类有人提出了异议 科学家利用mtdna和等位酶两种分子标记对此进行了分析 发现这两个种是已知种的杂交个体 由此可以确定 这两个种不需要花费更大的精力寻找野生种群进行保护 二 野生种群的遗传管理 确定目标物种的分类学地位增加种群数量复壮近交的小种群促进片段化种群之间的基因交流 其目的是制定广泛有效的管理策略 避免小种群和片段化种群走向 灭绝漩涡 摆脱遗传枯竭和灭绝风险的干扰 逐渐步入可持续生存的进化发展之路 一 确定类群的分类地位 划分种群内的管理单元 没有正确的分类系统就不可能有效地管理野生种群 这就要求我们确保物种的分类学鉴定是正确的 并明确定义不同的管理单元和进化显著单元 在大熊猫的保护遗传学领域探讨中 通过对6个山系的121份大熊猫样品进行扫描 产生了121个清晰易辨的dna指纹图谱 据此图谱 作者获得了6个山系遗传多样性的相关参数 提出 在大熊猫的物种保护中 仅凭种群数量的大小这一参数来确定其六个山系的优先保护顺序是不够科学的 二 评估实际种群大小 增加种群数量 找到导致物种濒危的原因阻止野生种群不断减少 并尽量增加种群数量通过法律手段控制捕猎和采收建立保护区提高现存生境的质量清除物种的捕食者以及竞争者 三 小种群的遗传管理 判定种群生存现状的重要指标在一定时间内种群的遗传多样性保持的某一水平通过诊断现有遗传多样性水平和丧失程度 近交衰退和片段化等问题 就可以估算出保持遗传多样性需要的最小种群数量 预测种群数量 种群增长速率 种群对数量参数变化的敏感程度和种群生存空间等对种群生存具有重要意义的参数 以及它们的变化对种群的发展趋势的影响 近交衰退 片段化种群的遗传管理 管理措施扩大生境面积提高现有生境的适宜性 增加密度通过人为地易地移育增加迁移率在种群已经灭绝的地区选择适宜的地点重建种群创建生境走廊 六个片段化种群 三 圈养种群的遗传管理 由于人类的影响 许多物种丧失了在自然栖息地生存的能力 就地保护和迁地保护是物种保护的两种主要形式 在野生状态下的物种即将灭绝时 圈养繁殖无疑提供了最后一套保护方案 波兰和白俄罗斯放归野外的欧洲野牛美国和加拿大的美洲野牛阿尔卑斯山脉的阿尔卑斯山脉羚羊阿曼的阿拉伯长角羚蒙古的普氏野马中国的麋鹿巴西的金狮狨美国的黑足鼬夏威夷的黄颈黑雁 一 人工圈养的目的和意义 二 人工圈养保护的原则 物种原有的生境破碎呈斑块状甚至消失 物种生存条件突然恶化 这类物种常常具有极窄的的生态位阈值 适应能力较差 生存能力脆弱 当生境条件某一个或某几个生态因子突然恶化时 将很快导致该物种的灭绝 野生种群数目下降到极低的水平 种内难以进行交配 iucn的策略是 当一个濒危物种的野生种群数量低于1000只时 就应当进行人工繁育 对于那些个体数目尚存较多 但已经出现生存危机的物种 也应该考虑进行圈养保护 三 人工圈养的利与弊 能为重新建立种群而增加个体的数量能开展对物种基础生物学的研究最终可以减少从野外捕捉个体的需求 捕捉之后能使剩下的野外小种群濒危开展繁育的场所需要有动物园和水族馆等场所种群会适应圈养环境 否能再适应自然环境个体因产生非自然的行为而导致学习行为的丢失人为造成的高密度会使圈养个体容易得病在圈养条件下 可能会影响物种进入繁殖状态 四 人工圈养种群的遗传管理 对奠基者数量的要求取决于等位基因数量和频率 以保持等位基因多样性 目前圈养种群管理目标是使随后的种群在100年内保持90 的遗传多样性 有必要选择拥有全面而有代表性等位基因的奠基者 迁地种群的存活率繁殖率以及世代间隔时间有效种群的大小种群的破碎程度奠基者效应种群结构的变化速率 近交和近交衰退通过人为设计的交配计划 使亲缘关系最小化 最大限度避免近交衰退和遗传多样性的丧失 在繁育配对时 应尽可能将无亲缘关系的个体配对 并让每一对繁殖个体产生数目大致相当的后代 保持繁殖群的相同性比 维持遗传多样性应用充足的奠基者使初始的遗传多样性最大化 这可以通过平衡家族大小 种群的性别比 动态种群大小以及延长世代长度等