免疫学实验诊断

第五章临床免疫学实验诊断昆明医科大学第二附属医院检验科 薛丽 第一节免疫球蛋白检查 1890年 Behring和北里在德国Koch实验室从豚鼠体内发现了第一种抗体 白喉抗毒素 从而挽救了成千上万的白喉患儿 从60 死亡率降到26 获1901年的第一届诺贝尔奖 Ab的发现 抗体与免疫球蛋白的发现 1939TiseliusandKabat Immunesera Normalsera 正常人血清电泳分离图 抗体 antibody Ab 机体免疫细胞被抗原激活后 由分化成熟的终末B细胞 浆细胞合成 分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白 免疫球蛋白的存在形式 膜型 membraneimmunoglobulin mIg B细胞膜上的抗原受体 分泌型 secretedimmunoglobulin sIg 分泌进入体液 介导体液免疫应答 免疫球蛋白的结构一 基本结构 四肽链结构经二硫键共价结合2条重链和2条轻链 S S S S S S N C L L H H 以IgG为例 一 重链 heavychain H 轻链 lightchain L 轻链 Lightchain 分为2型 和 型 Type 重链 Heavychain 分为5类 IgG IgG 和IgG IgM IgM 和IgM IgA IgA 和IgA IgE IgE 和IgE IgD IgD 和IgD S S S S S S N C H H L L N 二 可变区 variableregion V区 恒定区 constantregion C区 可变区VL VH S S S S S S N N L H VL CL VH CH1 CH2 CH3 三 铰链区 Hingeregion 含有较大量的Pro 具有柔韧性 可折叠 分别形成T型和Y型 S S S S S S N N C L H VH CH1 CH2 CH3 类和亚类 根据H链的抗原性不同 五类 IgG gamma IgA alpha IgM mu IgD delta IgE epsilon 亚类 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4IgA IgA1 IgA2 免疫球蛋白的功能一 V区的功能 识别并特异性结合抗原抗体分子 单体 IgG IgE 2价二聚体 分泌型IgA 4价五聚体 IgM 10价 5价 实际意义 a 中和效应 中和毒素和病毒b 与Ag结合 促吞噬细胞吞噬 二 C区的功能1 激活补体系统Ab IgM IgG Ag C1q 补体经典途径IgG4 IgA和IgE的凝聚物 补体旁路途径2 介导免疫细胞活性 1 调理作用 opsonization 抗体IgG的Fc段与中性粒细胞上的IgGFc受体结合 从而增强吞噬细胞的吞噬作用 2 ADCC 具有杀伤活性的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体识别结合于靶抗原上的抗体Fc段 直接杀伤靶抗原 3 介导超敏反应 型 型和 型超敏反应 免疫球蛋白的特性和功能一 IgG单体分子 四个亚类 血清中含量最高 75 Ig 半衰期最长 21 23天 3 5岁达成人水平 8 0 17mg ml 可与SPA结合 抗菌 抗病毒 抗毒素抗体大多为IgG 生物学活性 通过胎盘 新生儿抗感染 激活补体 裂解细胞 调理作用 促进吞噬 介导ADCC 细胞毒作用 实际意义 a 抗感染 b 自身抗体 自身免疫病 c 介导变态反应 II III型 d 封闭抗体 肿瘤细胞逃逸 e 亲合层析法 IgG纯化 f 免疫学检测 二 IgM1 五聚体 分子量最大 900kd 又称巨球蛋白 2 人类发育过程中最早合成的Ig 3 体液免疫应答最先产生的Ig 感染早期免疫 4 占血清Ig含量的5 10 5 半衰期 5天 血清中特异性IgM水平增高提示有近期感染 6 激活补体 7 IgM不能通过胎盘 脐带血或新生儿血清中IgM水平升高表明胎儿有宫内感染 8 B细胞膜IgM mIgM 体液免疫应答 9 自身抗体 自身免疫病 如 类风湿因子 针对IgGFC片段上抗原表位的一类自身抗体 三 IgA1 两种类型 血清型 IgA1 主要 单体 主要 分泌型 IgA2 主要 二聚体 主要 粘膜局部浆细胞合成 分泌片由粘膜上皮细胞合成 2 半衰期 6天 3 占血清Ig含量的5 15 4 粘膜局部抗感染免疫 5 聚合IgA激活补体替代途径 四 IgD1 单体分子 2 存在形式 分泌性 血清中 功能不清 膜结合性 B细胞表面 1 是B细胞成熟的重要标志 2 抗原受体 3 占血清Ig含量的1 4 半衰期 3天 五 IgE1 单体分子 2 血清中含量最低 占Ig的0 002 3 半衰期 3天 4 呼吸道和胃肠道浆细胞产生 5 介导I型超敏反应 与肥大细胞 嗜碱性粒细胞表面的Fc RI结合 6 过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异性IgE水平增高 免疫球蛋白 1 IgG IgG1 IgG4 含量最多 免疫防御最重要 新生儿抗感染重要 用于紧急预防 2 IgM 分子量最大 血管内抗感染的主要抗体 最早合成和分泌 早期诊断和宫内感染指标 mIgM是BCR 单体 3 IgA 分泌型IgA粘膜局部抗感染重要 婴儿从初乳可获得SIgA 4 IgD mIgD是BCR和B细胞成熟标志 5 IgE 血中含量最少 介导 型超敏反应 M蛋白测定 M蛋白是B淋巴细胞或浆细胞单克隆增殖 产生大量的均一免疫球蛋白 这种蛋白质的氨基酸排列顺序 空间构象 电泳特征皆相同 M蛋白表现在血液中而成M蛋白血症 多发性骨髓瘤及原发性巨球蛋白血症时 M蛋白以外的其他免疫球蛋白明显降低 血浆蛋白电泳约75 病人显示球蛋白区呈窄底高峰的单株Ig 50 60 90 100 50 60 室温 尿本 周蛋白 M蛋白测定 临床意义 1 多发性骨瘤 最多见 2 巨球蛋白血症3 重链病 4 半分子病5 恶性淋巴瘤6 良性M蛋白血症 老年人多见 原因不明 Ig测定临床意义1 Ig减低见于各类先天性和获得性体液免疫缺陷 联合免疫缺陷的病人及长期使用免疫抑制剂的患者 2 Ig单克隆性增高仅有某一种Ig增高而其他Ig不增高 主要见于免疫增殖性疾病 如 多发性骨髓瘤 巨球蛋白血症等 3 Ig多克隆性增高表现为IgG IgA IgM均增高 常见于各种慢性感染 慢性肝病 肝癌 淋巴瘤以及系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎等自身免疫性疾病 第二节血清补体检查 一 总补体溶血活性 CH50 测定主要反映补体经典激活途径的活化程度 CH50测定方法 致敏绵羊红细胞 待测血清 补体 绵羊红细胞溶血溶血率与补体活性正相关 50 溶血率即为CH50 一 总补体溶血活性 CH50 测定主要反映补体经典激活途径的活化程度 1 CH50增高见于各种急性炎症 组织损伤和某些恶性肿瘤等 2 CH50减低 1 补体成分大量消耗 血清病 链球菌感染后肾小球肾炎 自身免疫性溶血性贫血 类风湿性关节炎及同种异体移植排斥反应 2 补体大量丢失 外伤 手术和大失血 3 补体合成不足 肝硬化 慢性肝炎和重型肝炎 二 血清C3测定C3是含量最高的补体 由肝细胞及巨噬细胞合成 无论经典途径还是旁路途径C3都参与 可反映出补体的活化情况 参考范围 0 8 1 55g L临床意义 C3增高各种急性炎症 传染病早期 某些恶性肿瘤 以肝癌最明显 及排异反应等 临床意义 C3降低补体合成能力降低 肝脏疾病 补体合成原料不足 营养不良 补体消耗过多 多见于免疫性疾病进展期如 SLE 膜增殖性肾炎等 补体丢失过多 大失血 大面积烧伤 先天性补体缺乏 遗传性C3缺乏症 肾炎的病因鉴别 链球菌感染肾炎血清C3减少 病毒性肾炎血清C3含量正常 三 血清C4测定C4参与补体的经典激活途径 参考范围 0 16 0 47g L临床意义同C3 四 补体C1q测定补体C1的重要成分 临床意义同C3 五 B因子测定B因子是旁路途径的重要成分 临床意义同C1q 第三节免疫细胞检查 免疫细胞 免疫细胞 淋巴细胞 中性粒细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞 流式细胞术淋巴细胞亚群分析 流式细胞术 flowcytometry FlowCell 白细胞分化抗原 白细胞分化抗原 leukocytedifferentiationantigen CD 是指在血细胞在分化成熟为不同谱系 分化的不同阶段及细胞活化过程中 出现或消失的细胞表面标记分子 白细胞分化抗原除表达在白细胞外 也表达在红细胞系和巨核细胞系 血小板 还广泛分布于非造血细胞 CD大都是跨膜的蛋白或糖蛋白 常用的淋巴细胞表面标志物 淋巴细胞亚群T细胞 CD3 B细胞 CD19 NK细胞 CD3 CD16 CD56 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生免疫荧光标记最常用的荧光染料 荧光染料激发波长 nm 发射波长 nm 颜色 FITC488525深蓝色PE RDI 488575橙色ECD488620橙红色PeCy 5488670红色PeCy 7488755深红色PI488620橙红色APC633670红色 免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 荧光的测定 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生 发射的荧光波长与激发光波长不同 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色 通过波长选择通透性滤片 可将不同波长的荧光信号区分开 送入不同的光电倍增管 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征 激光 细胞悬液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 T细胞膜表面分子具有不同的抗原性 主要有CD3 CD4 CD8等 1 CD3分子 表达于所有成熟的T淋巴细胞表面 T细胞特有标志 反映T细胞总数的变化 2 CD4分子 辅助性T细胞 Th 表达 3 CD8分子 是抑制 杀伤性T细胞的标志 4 CD4 CD8比值 降低提示免疫抑制 升高提示亢进 免疫性疾病 T淋巴细胞及其亚群分析 CD3 T细胞 计算T细胞总数 CD4 CD4 T细胞 计算CD4 T细胞数 CD8 CD8 T细胞 计算CD8 亚群T细胞数计算CD4 CD8 比例 T淋巴细胞及其亚群分析 1 Th细胞 CD3 CD4 CD8 T细胞 能辅助B细胞分化成熟生成抗体产生细胞 桨细胞 参与促进细胞介导的免疫应答 T淋巴细胞及其亚群分析 2 Tc细胞 CD3 CD4 CD8 T细胞 能特异性直接杀伤靶细胞 所有表达MHCI类分子的靶细胞 抗肿瘤免疫 抗病毒感染 移植排斥反应和自身免疫疾病中均起了重要作用 B细胞约为5 10 标志为BCR SmIg 表达CD19 CD20 CD21 CD22分子 B细胞也是免疫系统重要的免疫细胞 主要功能是介导体液免疫 抗原递呈细胞 同时还能分泌细胞因子调节免疫应答 二 B淋巴细胞及其亚群 1 B1 CD19 CD5 产生IgM型自身抗体 参与免疫调节 与自身免疫病的发生有关 2 B2 CD19 CD5 受外来抗原刺激 产生高亲和性特异性抗体 BCellSubsets CD19是最重要的B细胞标记分子 B细胞升高见于B细胞系统的恶性肿瘤 B细胞降低见于体液免疫缺陷病及使用化疗或免疫抑制剂后 一组大颗粒的淋巴细胞 约5 10 标志CD16 CD56 CD2 CD11a CD18 用三色荧光标记将CD3 CD16 CD56 淋巴细胞定为NK细胞 主要功能是参与细胞免疫 在肿瘤免疫 抗病毒感染中均起重要作用 三 NK细胞分析 第四节临床常用的肿瘤标志物检查 肿瘤标志物 tumormarker TM 在恶性肿瘤发生和增殖的过程中 由肿瘤细胞合成分泌或者由机体对肿瘤细胞反应而产生和升高的 反映肿瘤存在生长的一类物质 包括肿瘤抗原 激素 酶与同工酶 多胺及癌基因产物等百余种 存在于血液 体液 细胞或组织中 一 蛋白质类肿瘤标志物检测 一 血清甲胎蛋白 alphafetoprotein AFP 测定胎儿发育早期 由肝和卵黄囊合成的血清糖蛋白 出生后不久逐渐消失 参考值 血清 25ug L 25ng ml 临床意义1 AFP是目前诊断肝细胞癌最特异的标志物 常高于300ug L 2 病毒性肝炎 肝硬化时 受损肝细胞的修复再生 幼稚化的肝细胞重新具有产生AFP的能力 但常低于300ug L 临床意义3 妊娠及生殖腺恶性肿瘤亦可高 4 孕妇血清中AFP异常升高 考虑胎儿有神经管缺损畸形的可能 5 18 的肝癌患者AFP不升高 需结合a L 岩藻糖苷酶检测 6 AFP异质体 不同来源AFP对小扁豆凝集素 LCA 的结合能力不同 LCA结合型 25 提示原发性肝癌 25 提示良性肝病 二 癌胚抗原 CEA 测定CEA最初发现于结肠癌组织中 参考值 血清 5ug L临床意义 恶性肿癌患者的血清中可发现CEA含量异常升高 常用于诊断消化器官的癌症 结肠癌 胃癌 胰腺癌 转移性肝癌等 CEA是一种广谱肿瘤标志物 在乳癌 肺癌及其他恶性肿瘤时也可升高 三 前列腺特异抗原测定前列腺特异抗原 prostatespecificantigen PSA 是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶 在前列腺癌时 前列腺腺管破坏导致血清PSA水平明显升高 临床意义1 前列腺癌患者血清PSA升高 2 前列腺肥大 前列腺炎 肾和泌尿生殖系统疾病 PSA轻度升高 3 5 前列腺癌患者血清PSA正常 需结合前列腺酸性磷酸酶 PAP 检测 四 组织多肽抗原 TPA 测定TPA是一种非特异性肿瘤标志物 其水平与肿瘤细胞的增殖分化有关 血清中TPA增高主要用于辅助诊断迅速增殖的恶性肿瘤 且在恶性肿瘤的疗效观察方面敏感性较高 参考值 血清 5ug L 五 鳞状细胞癌抗原 SCC 测定鳞状细胞癌抗原 squamouscellcarcinomaantigen SCC 是一种鳞癌肿瘤标志物 参考值 血清 1 5ug L临床意义1 诊断鳞癌 检测其疗效 复发 转移 2 肝炎 肝硬化 胰腺炎 肺炎 肾衰竭等SCC也可升高 3 血液标本应避免体液污染 二 糖脂类肿瘤标志物检测 一 癌抗原15 3 CA15 3 测定CA15 3是一种乳腺癌相关抗原 对乳腺癌的诊断及术后随访临测有一定的价值 二 糖链抗原125 CA125 测定CA125为一种糖蛋白性肿瘤相关抗原 存在于卵巢肿瘤的上皮细胞及患者血清中 主要用于辅助诊断恶性浆液性和上皮性卵巢癌等 三 糖链抗原19 9测定CA19 9又称胃肠癌相关抗原 临床意义1 胃癌 大肠癌 肝癌的诊断 2 可作为胰腺癌 胆管癌等的辅助诊断指标 3 急性胰腺炎 胆囊炎 肝硬化 肝炎等也可不同程度升高 四 糖链抗原72 4测定CA72 4是监测胃癌的首选肿瘤标志物 卵巢癌时CA72 4也升高 可与CA125联合检测 三 酶类肿瘤标志物检测 一 前列腺酸性磷酸酶 PAP 测定PAP是前列腺分泌的酶 PAP测定特异性高于前列腺特异性抗原 PSA 敏感性低于PSA 常联合检测用于前列腺癌的诊断 三 酶类肿瘤标志物检测 二 a L 岩藻糖苷酶 AFU 测定AFU是溶酶体酸性水解酶 广泛存在于细胞溶酶体内及血液 体液中 AFU与AFP联合测定用于原发性肝癌诊断 三 神经元特异性烯醇化酶 NSE 测定NSE是小细胞癌和神经母细胞瘤的肿瘤标志物 四 激素类肿瘤标志物检测 一 人绒毛膜促性腺激素 hCG 测定hCG是胎盘滋养层细胞分泌 生殖腺肿瘤时hCG升高 如 绒毛膜癌 恶性葡萄胎 睾丸母细胞瘤 精原细胞瘤 其他肿瘤也可升高 四 激素类肿瘤标志物检测 二 降钙素 calcitonin CT 测定甲状腺髓样细胞癌患者血清CT明显升高 其他肿瘤也可升高 第五节自身抗体检查 定义 抗核抗体 antinuclearantibody ANA 是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称 靶抗原分布 细胞核 细胞浆 细胞骨架 细胞分裂周期 原理 以猴 大鼠肝细胞或某些培养细胞 如Hep 2 建株人喉表皮样癌细胞 做抗原片 将病人血清加到抗原片上 如果血清中含有ANA 就会与细胞核成分特异性结合 加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合 在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光 结果判定 荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞 不发荧光为阴性 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性 否则为阴性 阳性待检血清