降糖药检测可行性方案.doc

降糖药检测可行性方案目的通过分析能够确定HPLC-ESI-IMS系统可以检测保健品中掺杂的降糖类药物。背景及意义保健品（health food），又称为功能食品，是指适于特殊人群适用，具有调节人体生理节律、预防疾病、促进身体健康的功能，不会对人体产生任何急慢性危害的安全无毒食品1。保健品具有非药属性，是以动植物等天然材料制成的具有特定功能的食物，不以治疗为目的，不能代替药物的治疗作用。随着生活水平的提高，人们对自身健康越来越关注，被认为安全无副作用的保健品受到了全世界消费者的青睐。近年来，由于人们生活节奏加快，体力活动减少，饮食水平提高，糖尿病已经变成了第三大威胁人类健康的慢性病。据报道，目前我国糖尿病发病率为9.7%，中国成人糖尿病患者已经超过1亿人。而不少患者在药物治疗的同时，选用对应的降糖类保健品配合食用，不法分子为了谋取暴利，有目的的在保健食品中非法掺入化学药成分,掺入的化学药物常常不止一种，且加入量并不均匀，患者在不知情的情况下服用非法添加降糖药物的保健品，严重的危害了消费者的身体健康。2012年，我国食品药监局公布的关于降糖类保健品的非法掺杂物质主要包括：甲苯磺丁脲、格列苯脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲、马来酸罗格列酮、瑞格列奈、盐酸吡格列酮、盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍几种。这些化学成分个都是用于临床治疗的处方药，患者在服用药品的同时再服用非法掺杂药品的保健品，会导致严重的低血糖；另外，这些化学成分在有效控制血糖的同时也具有一定的毒副作用,如格列本脲会造成低血糖；苯乙双胍可引起糖尿病乳酸性酸中毒,病死率高达50% 80%,且症状体征无特异性,一旦确诊,病情严重,治疗困难,美国FDA早已禁止用于临床,我国糖尿病协会也禁止60岁以上的老年人服用苯乙双胍2。已有检测方法降糖中成药中常用的黄芪、茯苓、白术、黄连、大黄等，而保健品中常见成分较多，如苦瓜，蜂胶，葫芦巴胶，肉桂粉等各种各样的天然成分。所以需要检测灵敏度和分辨率较高的检测手段。目前检测降糖类保健品中的非法掺杂物质的方法主要有高效液相色谱法、液质联用检测混合的药品法。其中HPLC的检测方法可以检测多种药品，但是由于双胍类（二甲双胍、苯乙双胍）极性较强，用HPLC检测保留时间较短很难分离出来；而液质联用检测效果后，但耗时较长且仪器较贵。可行性主要的降糖类掺杂(加粗字体是想要测的物质)：双胍类：盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍磺脲类：格列苯脲（低血糖）、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲胰岛素增敏剂：罗格列酮（引发心血管疾病）、吡格列酮（与双胍类、磺脲类合用增强效果）促胰岛素分泌剂：瑞格列奈文献3-5报道中HPLC可以分离各种物质，但容易发生二次保留现象。其中双胍类物质极性很强，用C18柱很快便从色谱柱中流出，较难分离，所以要采用酸性缓冲物，在流动相中加入少量甲酸等解决该问题。IMS目前能找到的IMS检测降糖药物的文献只有一篇6，是14年印度人利用MIP-ESI-IMS检测吡格列酮，最后得到的是大小两个峰，k0=1.10和1.15cm/vs。而其他物质有利用HPLC-MS检测时都是利用ESI正离子模式检测作为电离源，应该能够电喷出来7-10。下图为12种物质二甲双胍(metformin,Met)、苯乙双胍(phenformin, Phe)、吡格列酮(pioglitazone,Pio)、格列吡嗪(glipizide,Glip)、瑞格列奈(repaglin-ide,Rep)、格列齐特(gliclazide, Glic)、格列苯脲(glyburide,Glyb)、格列美脲(glimepiride, Glim)、格列喹酮(gliquidone,Gliq)等化学对照品,购自中国药品生物制品检定所。甲苯磺丁脲( tolbutamide,Tol)、罗格列酮(rosiglitazone,Ros)、那格列奈(nateg-linide,Nat)等标准物的分子结构： 样品均可以买到：双胍类：盐酸二甲双胍（100mg 220元）、盐酸苯乙双胍（100mg 280元）磺脲类：格列苯脲（50mg 200元）、格列齐特（100mg 390元）、格列吡嗪（100mg 220元）、格列喹酮（100mg 390元）、格列美脲（100mg 390元）胰岛素增敏剂：罗格列酮（100mg 390元）、吡格列酮（100mg 490元）促胰岛素分泌剂：瑞格列奈（100mg 750元）实验计划流动相：甲醇、水、甲酸11等（通过实验决定甲酸的量，0.2%左右开始尝试）常见的流动相时（甲醇，乙腈和磷酸盐的水溶液混合液）流程：1. 对几种样品的标准品进行单独检测确定漂移时间。2. 针对其中一种或几种样品进行浓度检测划定标准曲线（是否必要单独利用IMS检测，再用HPLC-IMS检测确定一下HPLC稀释了多少倍？）3. 通过HPLC-ESI-IMS进行检测分离几种标准品，并且标定保留时间。4. 进行不同浓度的检测，找到不同样品在HPLC-ESI-IMS的最低检测浓度。5. 购买实际药品进行检测，检测过程，首先稀释，超声，过滤，进样检测。参考文献1彭涛, 李晓娟, 代汉慧, et al. 色质联用技术在保健食品违禁化学物质分析中的应用J. 质谱学报, 2013, 33(6): 370-379.2刘福艳, 谢元超, 刘福强, et al. 液相色谱质谱联用法检测 2 种中药降糖制剂中非法掺入的二甲双胍, 苯乙双胍, 格列吡嗪, 格列本脲J. 药物分析杂志, 2009, (3): 440-444.3Arayne M S, Sultana N, Tabassum A. RP-LC simultaneous quantitation of co-administered drugs for (non-insulin dependent) diabetic mellitus induced dyslipidemia in active pharmaceutical ingredient, pharmaceutical formulations and human serum with UV-detectorJ. Clinica Chimica Acta, 2013, 425(0): 54-61.4朱炳辉, 龙朝阳, 吴西梅, et al. 固相萃取/高效液相色谱法对中成药和保健品中 7 种降糖化学药物的测定J. 分析测试学报, 2008, 27(5): 534-537.5万春花, 倪永年, 龙洲雄, et al. 反相液相色谱法同时测定六种降血糖西药成分J. 现代科学仪器, 2006, 6: 025.6Jafari M T, Kamfirozi M, Jazan E, et al. Selective extraction and analysis of pioglitazone in cow plasma using a molecularly imprinted polymer combined with ESI ion mobility spectrometryJ. Journal of separation science, 2014.7Pang W, Yang H, Wu Z, et al. LC-MSMS in MRM mode for detection and structural identification of synthetic hypoglycemic drugs added illegally to naturalanti-diabetic herbal productsJ. Chromatographia, 2009, 70(9-10): 1353-1359.8Binz T M, Villani N, Neels H, et al. Rapid extraction, identification and quantification of oral hypoglycaemic drugs in serum and hair using LCMS/MSJ. Forensic science international, 2012, 223(1): 119-124.9Jagadeesh B, Bharathi D V, Pankaj C, et al. Development and validation of highly selective and robust method for simultaneous estimation of pioglitazone, hydroxypioglitazone and metformin in human plasma by LCMS/MS: Application to a pharmacokinetic studyJ. Journal of Chromatography B, 2013, 930(0): 136-145.10Hess C, Musshoff F, Madea B. Simultaneous identification and validated quantification of 11 oral hypoglycaemic drugs in plasma by elec