液态活检在肿瘤研究的现状和趋势分析

液态活检在肿瘤研究的现状和趋势分析,内容概括,液态活检概念循环肿瘤细胞及其核酸游离肿瘤核酸,组织活检的局限性,很多肿瘤患者无法进行手术穿刺受检者严重的不合适穿刺自身的临床风险某些肿瘤解剖位置不便进行穿刺肿瘤的异质性,阿拉伯医生Albucasis （936-1013）及其发明的外科手术器械Folia Histochem Cytobiol. 2009年47卷2期191-7页,液态活检（liquid biopsy）,循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTCs）游离肿瘤DNA（ Circulating tumor DNA，ctDNA或者 Circulating Free DNA，cfDNA）,血检,CTC,CTC转移过程中必经阶段,CTC：是否是介导肿瘤转移的细胞？,J Clin Oncol. 2009;27(20):3303-3311J Clin Oncol.2008;26(19):3213-21Clin Cancer Res.2008 ;14(19):6302-9,CTC的生物学功能,Circulating Tumor Cell ClustersAre Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis,Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer Nat Med.2014;20(8):897-903,Cell Rep.2014Sep 25;8(6):1905-18,Cell.2014 28;158(5):1110-22,Single-cell RNA sequencing identifies extracellular matrix gene expression by pancreatic circulating tumor cells,CTC检测方法,与血液细胞相比，肿瘤细胞具有以下特征：体积更大；液相流动性更大；细胞膜的电容和电导特性不同；,CTC确认标准：DAPI染色阳性；组织来源相关CK染色阳性；CD45染色阴性；肿瘤相关抗原染色阳性 （MUC1，HER2，PSA et al.）其它辅助方法：FISH ， HE，PCR ， EPISPOT,EMBO Mol Med. 2015 Jan; 7(1): 111,CTC临床治疗治疗决策,预后预测不应只是一切的终点，而应是一切的开始,虽然CTC对接受一线化疗的转移性乳腺癌患者预后具有重要意义，但是针对一线化疗后CTCs仍升高的患者换用其它化疗方案并不能有效地延长患者生存期。,Circulatingtumorcellsandresponsetochemotherapyinmetastaticbreastcancer:SWOGS0500,CTC的分子特征,Solidifyingliquidbiopsies:cancirculatingtumorcellmonitoringguide treatment selection in breast cancer?,CTC的简单计数，并不能反应肿瘤细胞内在的生物学特性，而正是这种特性是决定了不同的肿瘤细胞对治疗具有不同的反应。因此，对CTC细胞的分子特性（例如药物靶向基因的表达，药物耐受相关基因突变的检测）的精细刻画，将有利于充分发掘CTC在指导临床治疗的价值。,TreatCTC: TrastuzumabinHER2-negativeEarlybreastcancerasAdjuvantTreatmentforCirculatingTumor Cells,在CANCER RESEARCH 全文下载不到,CTC单细胞测序,Method of the Year 2013,Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles（MALBAC）,multiple displacement amplification(MDA),MDA扩增方法优点：不引入接头序列SNV假阳性率较低 （0.001%）数据不易受外源DNA污染影响,MALBAC扩增方法优点：拟线性扩增，适合CNV分析；数据重现性较好,CTC单细胞测序优势,Whole-exome sequencing of circulating tumor cells provides a window into metastatic prostate cancer,对于异质性很强的肿瘤，CTC相比组织单一取材，更全面的代表了肿瘤组织的异质性，更适合于评估肿瘤的分子特征以及检测肿瘤进展。,Nat Biotechnol. 2014,32(5): 479484,CTC单细胞测序应用前景及挑战,NatRevClin.Oncol2014;11(3):129-144,CTC的分子特征实时评估将如何更好地辅助于：肿瘤疗效评估肿瘤转移进展监测和预防肿瘤治疗方案选择,挑战：提高CTC的检出率（不依赖抗体的CTC分离策略，CellCullector TM策略）；准确地判断具有生物学活性/功能的CTC（EPISPOT,CAM等策略）；CTC细胞分离，单细胞核酸WGA操作等样品制备的SOP和QC方案；CTC本身的异质性。,NatRevClin.Oncol. 2013;10(8):47284,ctDNA,1984-Mandel P,Metais P;Les acides nucleiquesdu plasma sanguin chez Ihomme.CRSeancesSocBiolFil, 142:241- 243,1977-LEON,S.A.et.al.free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.Cancer Res.37;646-650,1989-STROUN,M.et.al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patient.Oncology 46;318-322,2005-Dich F,et.al.Detection and quantification of mutation in the plasma of patiens with colorectal tumor Proc Natl Acad Sci USA 102;16368-16373,2008-Dichl F,Schmidt K,Choti MA,Romans K,Goodman S,Li M,et.al.Circulating mutant DNA to asscss tumor dynamics Nature medicine 2008 14, 985 - 990,Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985990,Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985990,Proc Natl Acad Sci USA.2015 Mar 17;112(11):E1317-25,含量低（1.0%总cfDNA）,片段短（180-200bp）,半衰期短（2小时）,ctDNA的检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战！,ctDNA性质,ctDNA检测方法,数字PCR的特点：极高的敏感性；只能针对确定的SNP位点；可同时检测位点的通量较低。,J Clin Oncol 2014 Feb 20;32(6):579-86,数字PCR,目标序列捕获测序-基于PCR,Sci.Transl.Med.2012 ,4(136):136ra68,较短的区间（6kb）,Plasma circulating tumor DNA as an alternative to metastatic biopsies for mutational analysis in breast cancer,Annals of Oncology,2014,25(10):1959-65,An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage,Nat Med. 2014, 20(5): 548554,NSCLC selector.共125kb,包含了囊括了139个基因的521个外显子,13个内含子。在测试的两个肺癌病人群体中（229例/183例），囊盖率达到96%或88%，每个病人可检测到的中位突变数为4个。,50-105mer/探针，高密度，更适合ctDNA检测。,目标序列捕获测序基于探针捕获,ctDNA应用肿瘤实时监测,标签捕获,实时监测,进展评估,N Engl J Med 2013; 368:1199-1209,ctDNA应用肿瘤进化（耐药）,Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA,定点检测手段（如数字PCR），在评估和监测肿瘤克隆演化方面具有较大的局限性。,Nature.2013;497(7447):108-12,ctDNA应用早期诊断,Sci Transl Med 6, 224ra24 (2014),在使用高灵敏度检测ctDNA突变方法的前提下，ctDNA的早期肿瘤中的检出率要高于CTC。,ctDNA应用肿瘤基因分型,Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA,Nature med.2014; 20(4):430-435.,ctDNA应用微小残留病,ClinCancerRes.2014;20(10):2643-50,DetectionofcancerDNAinplasmaofpatientswithearly-stagebreast cancer.,应该注意到，一些符合传统根治性标准的病人，在ctDNA分子水平上并没有发生显著缓解。,ctDNA分子学层面的缓解与否，是否能够辅助评估肿瘤手术治疗根治性程度，以减少一部分无需进行术后辅助化疗的病人接受相应治疗，所承担的不良反应和经济负担。,Minimal residual disease inbreast cancer: in blood veritas.,ClinCancerRes.2014;20(10):2505-7,ctDNA应用的挑战,高灵敏度的定点检测（SV检测灵敏度1/500000，SNV检测灵敏度1/20