抗寒鉴定实验方案.doc

一、 油菜抗寒性评价实验方案（三个方面：与抗寒性相关的性的主要植物学特征特性、生理生化因子、生长发育特性）种子萌发及苗期一 问题提出及目标 关于植物抗寒性的评价，国内外学者已经提出了一大批与抗寒性测定有关的形态指标和生理生化指标(张钢，2005；徐燕等，2007)。由于抗寒性是许多数量或质量遗传基因综合作用累加的结果，每一个与抗寒性有关的性状对植物抗寒性都起一定的作用，但这种作用是微效的。所以，单一指标评价抗寒性具有片面性，用多个指标综合评价植物的抗寒性才较为可靠。目标：通过对油菜抗寒性的各项指标的试验，选择合适的评价指标建立油菜抗寒性鉴定的综合评价技术规范。研究提纲1 材料：B.rapa 与B.napus各4个材料,分别为超强抗寒性、强抗寒性、抗寒、一般抗寒类型的材料。2 试验设计：34 研究内容：1.1 植物性特征特性1.1.1细胞膜透性1.1.2 叶表皮气孔数1.1.3气孔大小1.1.4叶面蒸发强度1.1.5 叶片厚度1.1.6 叶表面刺毛状1.1.7 叶绿素含量1.1.8 根部性状：根长，根颈直径、根量1.2 生理生化特性1.2.1 地上部1.2.2 地下部1.3 生长发育特性1.3.1地上部出叶速度、出叶量、干鲜比1.3.2 地下部生长量、干鲜比1.3.3 衰老二、实验假设与理论依据发芽指数 萌芽率 相对电导率 游离脯氨酸含量 可溶性糖含量 丙二醛含量 超氧物歧化酶（SOD）活性 过氧化氢酶（CAT）活性 过氧化物酶（POD）活性及同工酶分析等都可作为植物抗寒性检测指标，本实验旨在通过严格控制各项试验影响因素，从中找出几项更稳定指标，并运用数学方法确立一个反应抗寒性的量（综合抗寒指数）来建立油菜抗寒鉴定评价规范。三 抗寒筛选试验方案简述1选取全国有代表性的油菜种子，进行种子萌发实验，依次20， 15 ，10，7， 5，3，1低温处理，以25为对照(CK)。降温速度为1/h。到温度点后保温进行萌发，定期取样，随着处理温度的降低，萌芽率会逐渐降低。假设经在3低温处理后大部分种源的萌芽率明显下降，且种源间差异较大；即以3低温处理后的各种相对萌芽率作为抗寒性的衡量指标。应用相关分析法，计算各3低温处理后的一系列生理指标(可溶性蛋白、可溶性糖、POD CAT SOD、MDA含量和相对电导率)与相对萌芽率的相关性。2 抗寒指标的选取根据相关性分析的结果，取极显著或显著相关的指标建立油菜种源抗寒性的评价体系。3抗寒综台评价体系的建立不同指标进行主成分分析，一般认为如果主成分分析中所提取主成分的特征值有70以上的贡献率，就可以用这个或几个主成分对事物的属性进行概括性分析，基本可以得出影响事物性质的主要因素。由此可以得到对抗寒性影响最大的指标 ？ 。4 建立“综合抗寒指数”评价法由于各指标的性质、单位和数量不同，故需要对这些指标进行标准数量化。各指标变化具有连续性质故采用连续性质的隶属度函数，据加乘法则：I=W x F(x) 其中：W为抗寒性指标的权重向量；F(x)为各指标的隶属度值)，对各指标进行合成，计算各种源的抗寒性综合指数。根据综合指数的大小，即可知各品种抗寒性强弱的排序。l 材料与方法 1 .1 试验材料 供试品种为 （甘肃农业大学提供）。种子无病虫害无破损，本批试验种子千粒重为 g ， 长轴长 c m， 短轴长 c m。清水选种：晴天或天气干燥时，在容器内放足水，倒人种子进行搅拌，之后捞去浮在上面的轻种、杂质，最后捞出下沉的种子晾干。操作时动作要迅速，以免病原物因长时间浸水而下沉，从而影响水选效果。种子用清水浸12h ，冲洗3次，杀菌剂处理(0 .1的高锰酸钾溶液中浸泡3 0-6 0 min，清水冲洗 3次。每处理挑选 100粒饱满种子试验，6次重复将种子均匀排列在垫有 2层滤纸的培育皿中，加盖一层薄的纸巾，加入适量蒸馏水，盖上培养皿盖，暗光发芽，定期喷水。 ( 资料光照 1 0 h，黑暗 1 4 h ，温度 ）1.2试验方法 1.2.1 温度筛选试验：I对照 ( C K)，不做低温胁迫处理，温度25（室温）：低温胁迫，处理温度梯度依次为20，15 ，10，7，5，3， 1。降温速度为1/h。每到一温度点，保温24小时后开始取样，测有关指标，6个重复中3个取样测生理生化指标，3个统计萌发率 发芽指数。找出大部分种源的萌芽率明显下降，且种源间差异较大的温度时间点。资料 计算发芽指数G I =G tD t ，G t为在t日的发芽数，Dt为相应的发芽日数。萌芽率 =( 发芽种子数种子总数) 100。发芽率( ) = ( 7 d的种子发芽数 供试种子总数) x 1 0 0 ； 发芽势= ( 3 d的种子发芽数供试种子总数) x 1 0 0 ；1.2.2 正式试验： 做如下处理 ：I对照 ( C K)，不做低温胁迫处理，催芽温度为25（室温）：低温胁迫，处理温度3（前面筛选结果）梯度降温至3，降温速度为1/h。降到所需温度维持24 h（关键点）后取样检测:以后每24小时取样一次，（一次/多次？）保存于-7 0冰箱，待测酶比活力等有关指标 。以上培养光照均为3000l x，光照时数,14h/d。1.3实验记录培养l d后开始统计发芽数，每隔2 4 h统计1次，待发芽结束后计算种子的发芽率、发芽指数（资料）； 该处理连续（ ）4d无种子萌发时结束试验并统计发芽率。以胚根突破种皮5mm定为发芽标准。1.4种子低温下萌发的生理生化指标测定 （测定方法见 邹奇植物生理学实验指导北京：中国农业出版社，2000）电解质渗漏率的测定 ：每组各取1 5粒种子经蒸馏水冲洗后，置于盛有3 0 ml去离子水的三角瓶中，在 2 5下平衡 3 h，用 DDS - 1 1 C电导仪测定各组浸液电导率 A；然后将三角瓶置于煮沸水中2 0min，以杀死种 子，再冷却至初始温度时，测电导率B，以相对电导率表示电解质渗漏率 。超氧物歧化酶（SOD）活性过氧化氢酶（CAT）活性 过氧化物酶（POD）活性丙二醛(MD A)含量测定采用硫代巴比妥酸法 游离脯氨酸含量 可溶性糖含量 陇6样 品编 号 1 2 3 4 5 6取样 统计 1 2 3 4 5 6 7 8 9 104 结果与分析五实验安排 1. 从陇6开始，作为第一个实验样品，设6个重复，总共18个培养皿，每次取9个样，1天一次，依次记录得到发芽指数，相对出苗率。 再测定相对电导率， 游离脯氨酸含量， 可溶性糖含量， 丙二醛含量， 超氧物歧化酶（SOD）活性， 过氧化氢酶（CAT）活性 ，过氧化物酶（POD）活性。 然后依次是 。六苗期方法基本同上 6.1幼苗生长 种子室温下浸4h，然后置于2 8恒温箱中催芽，当8 0 种子露白即可播种于盛有蛭石的 1 01 0苗圃钵中，每个品种 3钵，每钵留苗34株 ，露天培育至45片真叶时， 将其移人人工气候箱( L R H一4 0 0一G S微电脑控制 ， 光照10000L x，时间14hd ) 。每3d浇1次水，每隔10d，每钵浇18剂量的40mlMS营养液培养。待长至56片真叶时开始进行以下处理：I对照 ( C K)，不做低温胁迫处理，温度为25（室温）；低温胁迫，每2d降温 1 ，每个温度设 6个 重复