酶联免疫斑点技术.doc

酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。但该方法不够灵敏。另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。2. ELISPOT技术的基本原理2.2ELISPOT 检测原理.在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin) 标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase , AKP) 或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP) 标记的链亲和素结合。经底物,如BCIP/ NBT孵育后, 在PVDF 孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。2.2ELISPOT技术原理.ELISPOT的技术原理与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。其实验设计是在96 微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin) 的单克隆抗体。然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell ,PBMC) ) 分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌CK,此时局部(紧靠分泌细胞的周围) 分泌出的CK会被PVDF 薄膜上包被的特异性抗体捕获。洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。然后将未结合的酶洗除,再以AKP 或HRP 标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/ NBT) 使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。斑点多少可以在ELISPOT读数系统上进行自动化计数或在立体显微镜上进行人工计数。当然也可以在96 微孔培养板上包被特异性捕获抗体来检测特异的CK分泌细胞。3. ELISPOT技术的优缺点3.1优点.(1) 侧重于细胞检测, 弥补了体液中CK 半衰期短的不足, 当体液中某CK 含量较低时, 用ELISPOT 法检测具有较高灵敏性。(2) 既可检测自发分泌细胞, 又可检测抗原特异性CK 分泌细胞, 具有较高特异性, 并可观察药物治疗反应,且首次使对CSF 中T、B 细胞研究成为可能, 对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。(3) 因新鲜标本来源的限制, 作者实验室用ELISPOT 法试测了经过程序冰冻冻存的外周血或CSF 单个核细胞的分泌功能, 发现与新鲜标本差异无显著性, 既可减少试剂浪费, 又可利于临床做回顾性或前瞻性研究。3.2缺点.(1) 比ELISA 技术复杂而费时, 需严密控制实验条件, 操作人员需技术熟练, 并能对实验结果进行分析, 以减少实验偏差。(2) 属半定量方法, 试剂比ELISA 价格贵, 当细胞产生大量CK时, 不宜选用ELISPOT , 而可选用ELISA。4. ELISPOT技术的应用及展望IFN-是由Thl细胞亚群分泌的一类细胞因子，能够促进CTL、NK细胞及巨噬细胞的活化和增殖，介导细胞毒效应，在抗病毒感染中发挥着重要作用。目前检测NDV诱导特异性IFN-的方法主要是ELISA试验，但该方法只能定性检测培养上清中IFN-含量，而无法进行细致的免疫学机理研究。酶联免疫斑点法(EHSPOT)是基于ELISA试验发展起来的，即可从单细胞水平检测抗体分泌细胞，又可以检测分泌量的一种细胞免疫学检测技术。从脾淋巴细胞的浓度、培养时问、抗原刺激量等方面确立了检测NDV诱导特异性IFN-的ELISPOT方法，进而为新城疫细胞免疫的研究提供了一种更为准确、灵敏、特异的试验方法。目前，ELISPOT法在全球尚未完全标准化，研究人员必须采用最佳匹配(best pair)的包被抗体和检测抗体、ELISPOT 板、形成斑点的底物及其显色时间等。如果上述因素都能够标准化，就可以在许多研究领域中快速获得有可比性、更有价值的免疫学研究成果，从而为免疫学研究开辟新的研究思路和方法。现在ELISPOT主要用于医学研究中。对于疫苗研究，中国药品生物制品检定所