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第三节病毒学研究的基本方法 1 内容一 理化因素对病毒的作用二 标本的采集和处理三 病毒的分离培养四 病毒的鉴定五 病毒定量的几个概念 2 一 理化因素对病毒的作用理化因素包括热 辐射 pH和化学试剂等对病毒的灭活作用 其作用的的结果是 改变和破坏病毒核酸 使其失去转录和翻译的功能 或者是改变和破坏病毒蛋白衣壳或脂质等结构 从而消除病毒的感染性 但是经灭活的病毒可继续保持其抗原性以及诱导产生干扰素 3 了解各种理化因素对病毒的灭活作用 有着重要的实际意义 由于不同病毒对各种理化因子的敏感性不同 因此在消毒时必须针对该病毒特点 选择最为有效的消毒剂 相反 在保存毒种或病毒材料时 则必须注意防止和避免各种灭活条件 病毒对不同理化因素的抵抗力 也是鉴定病毒的一个重要依据 4 一 温度病毒喜冷怕热 大多数病毒可在4 以下良好地生存 特别是在干冰温度 70 和液氮 196 下更可长期保持其感染性 相反地 大多数病毒可在55 60 条件下几分钟到十几分钟内灭活 100 可在几秒钟内灭活 因此必须低温保存病毒和疫苗等 5 各种病毒对热的抵抗力不同 甚至有着明显的差异 例如 黏病毒和RNA肿瘤病毒等具有包膜的病毒 感染半衰期为37 1h而痘病毒在干燥状态下 却可耐受100 加热5 10min热对病毒的灭活作用 受周围环境因素的影响 蛋白质以及钙 镁等离子的存在 常可提高某些病毒对热的抵抗力 6 长期保存病毒一般采用下述两种方法 1 快速低温冷冻于病毒液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂 最好再加入5 10 的二甲基亚砜 并迅速冷冻和保存于 70 196 对含病毒的组织材料可以直接低温冷冻保存 如有些病毒可先浸入50 的甘油缓冲盐水中 再行低温保存 效果更好 7 2 冷冻干燥在真空条件下使冰冻病毒悬液脱水 通常是冷冻真空干燥 可保存几年甚至几十年 毒力不变 毒种的保护剂 一般用脱脂牛乳 经灭活的动物血清 饱和蔗糖溶液等 真空干燥时 将病毒液加等量保护剂 每支装0 2 0 5ml 放入冻干机内冷冻 现代冻干机具有冷冻 干燥 抽真空等全部装置 使用十分方便 8 二 pH值大多数病毒在pH6 8的范围内保持稳定 在pH5 0以下的酸性环境中 以及pH9 0以上的碱性环境中 病毒大多迅速灭活 酸 碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂 贮存病毒 以中性或微碱性为宜 例如病毒病料置中性的50 甘油盐水中保存 9 但是必须指出 各种病毒对pH变化的稳定性可能显著不同 例如 呼肠孤病毒能够抵抗pH3 0 口蹄疫病毒在pH6 0 6 5及pH8 0 9 0迅速灭活 猪水泡病病毒在pH2 2条件下24h内仍保持其感染性 因此pH的稳定性 是鉴定某些病毒的一个重要指标 10 三 辐射电离辐射中的 射线和X射线以及非电离辐射紫外线 都对病毒呈现灭活作用 其原因是它们可以破坏病毒核酸的分子结构 使其失去生物活性 11 四 超声波和光动力作用超声波主要以强烈振荡对细菌和其他微生物以及细胞等呈现破坏作用 但对病毒的灭活作用并不明显 常用超声波破坏细胞 使病毒粒子从细胞内释放 以便收获和提纯病毒 有些病毒核酸被染料 如甲苯胺蓝 啶橙 作用后 就能被可见光灭活 称为染料的光动力作用 12 五 脂溶剂乙醚 氯仿和丙酮等脂溶剂对有包膜的病毒具有灭活作用 乙醚等灭活试验是鉴定病毒的一个重要指标 13 六 甘油和抗生素应用50 的甘油盐水 病毒可以存活数日 甚至几年 生产实践中常用50 甘油盐水保存病毒材料 同时采取冷藏措施 效果较为理想 一般的抗生素对病毒无作用 故常加入到含有病毒的材料中去 以杀死细菌而有利于病毒的分离与培养 近年来 人们已发现一些抗生素对病毒有作用 有的已用在病毒病的预防和治疗上 如金刚铵 利福霉素 放线菌素D等 14 二 标本的采集和处理用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒 因此必须根据病毒的生物学特性 病毒感染的特征 流行病学规律以及机体的免疫保护机制 来选择所需要采集标本的种类 确定最适采集时间和标本处理的方法 标本采集必须无菌操作 如有细菌污染 可通过加抗菌素 过滤和离心等方法处理 由于大多数病毒对热不稳定 所以标本经处理后一般应立即接种 15 若需要运送或保存 数小时内可置于50 中性甘油内4 保存 对需较长时间冻存的标本最好置于 20 以下或干冰保存 以感染病毒的动物病料采集为例 一般说来 应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料 例如上呼吸道疾病取鼻分泌物 脑炎取脑组织 痘症取患部皮肤 采集病料的时间 以症状刚出现时为佳 检查抗体时 则采取一个病畜的初期和恢复期的血清 以了解抗体滴度的变化 16 三 病毒的分离培养病毒与细菌不同 病毒是严格的活细胞内寄生的 因此分离培养病毒应采用 寄主 易感动 接种法鸡胚培养法细胞培养法而且还必须根据不同病毒的要求进行选择 才能得到满意的结果 17 一 寄主接种法分离的标本接种于实验寄主的种类和接种途径主要取决于 病毒寄主范围组织嗜性同时还应考虑操作 培养及结果判定的简便 18 动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部位 嗜神经病毒接种于动物脑内 嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔 常用动物有 实验动物 小白鼠 大白鼠 地鼠 家兔和猴子等 本动物 接种病毒后 隔离饲养 每日观察动物发病情况 根据动物出现的症状 初步确定是否有病毒增殖 19 实验动物接种1 实验动物培养病毒的优点和缺点 3 实验动物接种病毒的用途 2 实验动物的等级 普通级实验动物 conventionalanimals CV 清洁级实验动物 cleananimals CL 无特定病原动物 specificpathogen freeanimals SPF 无菌动物 germ freeanimals GF 悉生动物 gnotobioticanimals GA 20 二 鸡胚培养法不同的病毒可选择不同日龄的鸡胚和不同的接种途径 如 痘病毒接种于10 12d的鸡胚绒毛尿囊膜上 鸡新城疫病毒宜接种在10d尿囊腔和羊膜腔内 虫媒病毒宜接种于5d卵黄囊 继续培养观察 21 鸡胚接种1 鸡胚接种病毒的优点和缺点2 鸡胚的构造 接种途径和方法 22 鸡胚培养法的缺点 1 一般的病毒通常并不使鸡胚产生特异性的感染指征 2 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母源抗体 3 某些病原体可以从感染母鸡向鸡胚传播 4 通常鸡胚种含有白血病病毒 5 鸡胚种可能有抗菌素残留 23 鸡胚构造 24 接种途径 1 绒毛尿囊膜接种 主要用于在绒毛尿囊膜上形成痘斑样病变的病毒 接种日龄10 12日龄 2 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒的接种 接种日龄10 11日龄 3 卵黄囊接种 主要用于虫媒披膜病毒 立克次氏体和衣原体的接种 接种日龄6 8日龄 4 羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒的接种 接种日龄为10 12日龄 25 鸡胚接种后的结果判定 1 24小时死亡鸡胚弃去不用 不能认为是因病毒增殖致死 2 尿囊液清凉3 鸡胚死亡或鸡胚出现病变等异常 26 三 细胞培养法细胞培养是目前最常用的方法 用机械方法或胰蛋白酶等方法将离体的活组织分散成单个的细胞 在平皿中制成贴壁的单层细胞 然后铺上动物病毒悬液进行培养 27 组织培养 1 概念 原指动物或植物组织小块的体外培养 现已泛指体外的组织 器官和细胞培养 组织 块 培养 将动物组织切成小块 在固定或悬浮条件下培养 该法是最早的组织培养方法 器官培养 取器官薄片 气管环 进行培养 使其基本保持原来的结构和功能 细胞培养 应用胰酶等细胞分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液 加入细胞营养液 使其生长繁殖 28 组织培养 根据培养细胞类型不同1 原代细胞培养 直接从动物组织制备的单细胞进行培养优点 病毒对天然宿主细胞最敏感 适应于病毒的分离缺点 有时存在携带潜伏病毒 29 无菌取动物活组织 洗涤数次 剪碎组织 消化组织 洗涤消化组织 机械吹打 纱布滤过 滤过细胞悬液细胞计数 培养液稀释所需细胞浓度 分装到培养瓶 37 培养 30 2 二倍体细胞养 原代细胞长成单层后 经胰蛋白酶或EDTA等细胞分散剂将细胞从培养瓶玻面上消化下来 使细胞分散 加入培养液 重新分装到培养瓶中 使细胞长成细胞单层 如此传代 细胞的染色体与原代细胞的染色体数相同 为二倍体 所以又叫二倍体细胞培养或叫继代细胞培养 优点 细胞碎片少 潜伏病毒容易发现 对病毒的敏感性和原代细胞相似 缺点 不能无限制的传代下去 并不是所有的细胞都能继代下去 31 组织培养 3 传代细胞系在体外可以无限制地传代下去 这类细胞多属癌变细胞 具有很高的生长和增殖优势 这类细胞的染色体已经发生改变 又称为异倍体细胞 优点 容易培养 生长迅速 易于获得和操作 缺点 对病毒分离不够敏感 不能用这类细胞培养的病毒制备疫苗 32 组织培养 根据培养方法不同1 静置培养培养方法简单 产量少 33 组织培养 根据培养方法不同2 转瓶培养 转管培养 细胞悬液分装到圆瓶中 培养时玻瓶不断缓慢转动 5 10转 分钟 细胞贴附于玻瓶四周 并长成单层 细胞产量高 节省培养液 但需要一定的培养装置 34 组织培养 3 悬浮培养细胞产量高 适应于传代细胞 不适合原代细胞培养 根据培养方法不同 35 组织培养 根据培养方法不同 4 微载体细胞培养利用对细胞无毒性的微小颗粒 按一定比例放入混悬的培养的营养液中 作为细胞附着增殖的载体 大大扩大了细胞长成单层的附着面 充分利用生长空间和营养液 达到了提高细胞产量的目的 36 常用的细胞培养 37 细胞圆缩 细胞的折光率增强 形态逐渐变圆 感染细胞由局部逐渐扩散到整个单层 细胞死亡 有的从玻面上脱落下来 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 38 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 细胞聚集成丛 类似葡萄串状 细胞与细胞之间常有细丝细胞间桥连接 39 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 多核巨细胞的形成 感染病毒的细胞 膜发生融合 形成一个合胞体 内有多个核 40 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 细胞内空泡形成 在病毒感染的细胞内形成大的气泡 41 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 细胞脱落 病变细胞从玻面上脱落 进入到细胞培养液中 使贴壁细胞明显减少 细胞变得疏松 42 病毒感染细胞后的细胞病变效应 Cytopathiceffect CPE 包涵体 InclusionBodies 病毒感染细胞后 在胞浆或胞核内出现的特殊结构 核内包涵体和胞浆内包涵体 43 44 45 46 47 四 病毒的鉴定病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法 也是病毒分类的前提 一般可通过以下方法确证病毒的存在 48 一 病毒的群体形态特征1 噬菌斑噬菌斑 plaque 测定一般采用双层平板法 将一定量经稀释的噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基 1 琼脂 混合均匀后 然后倒入含底层琼脂培养基 2 琼脂 的平板 经过一段时间培养后 在细菌菌苔上会出现一个个圆形局部透明区域 即噬菌斑 可以认为 每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果 一个噬菌斑中的噬菌体遗传性都相同 故通过多次重复接种 可获得纯系噬菌体 因每种噬菌体的噬菌斑有一定的大小 形状 边缘和透明度 故可作为鉴定的指标 此外 噬菌斑亦可用于病毒的定量 49 1 噬菌斑 2 菌苔 50 51 52 53 54 55 56 2 空斑和感染病灶一些动物病毒在动物细胞或组织培养系统培养时 由于病毒感染细胞裂解 出现与噬菌斑类似的空斑或称蚀斑 如果是肿瘤病毒 细胞不是被溶解 而是生长速率增加 导致受感染细胞堆积起来形成类似于菌落的感染病灶 3 枯斑一些植物病毒会在茎 叶等植物组织上形成一个个褪绿或坏死的斑块称枯斑或坏死斑 57 二 血凝现象及干扰现象血凝现象是指许多病毒能吸附于一定种类哺乳动物或禽类的红细胞表面而产生凝集的现象 如流感病毒 天花病毒等 可根据病毒凝集的血细胞种类及凝集条件不同而鉴定病毒 两种不同的病毒同时或先后感染同一宿主细胞时 一种病毒抑制另外一种病毒增殖的现象 称为病毒的干扰现象 interference 如乙型脑炎病毒能干扰脊髓灰质炎病毒 流感病毒能干扰西方型马脑炎病毒的增殖等 若在某一组织细胞培养物中同时加入接种物及可被干扰的病毒 若后者被抑制 则可间接判断接种物中存在可干扰后者的病毒 58 59 60 61 三 细胞病变效应 CPE 是指病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的明显表现 例如 细胞发生凝缩 团聚 肿大 细胞融合形成多核现象 细胞脱落 裂解 细胞内出现包涵体等 用于细胞培养的标本一般以细胞病变效应作为病毒感染的指标 62 细胞病变是特定的病毒与细胞相互作用的结果 不同病毒感染同一细胞时可能呈现不同的细胞病变效应 同一病毒在不同的细胞上也可引起不同的效应 此外 培养液成分 温度 病毒感染时细胞年龄等也会对细胞病变效应 CPE 产生影响 63 1 细胞融合现象细胞融合现象 phenomenonofcellfusion 是指由于病毒感染宿主细胞而出现的多核细胞现象 2 包涵体某些细胞在感染病毒后 出现于细胞质或细胞核内的 在光镜下可见的 大小 形态和数量不等的小体称为包涵体 Inclusionbody 64 四 其他鉴定方法形态学鉴定 电镜技术理化性质分析 热 紫外线 脂溶剂等理化因子对病毒感染性的作用 病毒组分