囊胚培养技术

囊胚培养技术进展,受精卵一旦形成，随即启动卵裂机制。在第3、4天时受精卵已分裂为约100个细胞的内细胞团。经输卵管蠕动细胞团被送入子宫腔，通过表面粘性物，贴附与子宫内膜，靠近子宫内膜的细胞分泌一种酶，将子宫内膜细胞裂解，形成一个小洞，从受精后的5、6天开始至第11、12天，整个胚泡埋入内膜，该过程称为“着床”或“植入“。胚泡植入后，子宫内膜重新长好，胚泡表面的滋养层细胞不断分裂，长出绒毛状突起，形成许多绒毛，伸入子宫内膜，吸收母体营养,胚胎培养：将卵泡液中捡出的成熟卵细胞洗涤后，置于含人血清白蛋白的授精液中，于37、体积分数为5的C02培养箱中培养，46 h后授精。授精后16-18 h转移入卵裂培养液中，观察受精情况，记录原核情况。第3天时观察胚胎的发育情况，记录胚胎的卵裂球数及分级。囊胚培养：胚胎移入预先平衡好的囊胚培养液中，于37、体积分数为5的C02培养箱中培养。培养2 d后观察囊胚形成情况。,胚胎早期培养,发育阻断,在离体培养哺乳类（包括人）受精卵时人们发现，在一些化学成分确定的培养基中，受精卵往往不能发育到囊胚，而是停顿在某个特定的发育时期。这种现象被称作“发育阻断”。发育阻滞的时期随物种不同而异，例如，大鼠和小鼠的发育阻滞发生在2细胞期以后，人发生在4-8细胞期，牛、羊等发生在8-16细胞期，兔发生在桑葚胚期。,普通胚胎移植大多数试管婴儿中心选择第3天胚胎来移植，胚胎已发育到8细胞。在IVF中，囊胚培养是“胚胎体外培养”的终末阶段，它通常形成于卵子受精后的第5-6天。自然生理状态下，早期胚胎在输卵管中发育，直到接近囊胚期才进入子宫。因此，利用体外培养技术将胚胎培养至囊胚期再植回子宫腔，能获得较高的胚胎植入率。,囊胚移植的优势,(1)使胚胎发育与子宫内膜/种植窗同步,更符合生理着床时间,从而提高IVF-ET的胚胎种植率,同时可提高临床妊娠率并减少胚胎移植数量,进一步降低多胎妊娠率;(2)进一步淘汰具有遗传缺陷、无发育潜能的胚胎,使可供移植的胚胎得到筛选;(3)缩短了胚胎移植入子宫腔后进一步发育与着床之间的间隔,且子宫收缩逐渐减少,可减少胚胎排出体外的机会,有利于胚胎着床;,(4)为分裂期胚胎活检,进入植入前遗传学诊断(PGD)提供时间,另外,可直接对囊胚的滋养层细胞进行活检,由于提供了较多的细胞来源,进而提高了诊断的准确性;(5)为人胚胎胚胎干细胞技术研究提供细胞来源。因此,囊胚培养和单囊胚移植已成为许多生殖中心提高妊娠率,并降低多胎发生率的重要手段之一。,囊胚培养技术的发展,共培养技术及作用机理,共培养：是指在胚胎体外发育的培养液中加入一些体细胞作为营养细胞与胚胎一起培养，如输卵管上皮细胞或子宫上皮细胞共同培养等，建立共培养体系以促进胚胎发育，克服胚胎体外发育阻断，提高胚胎移植率。第一，在胚胎发育过程中能自分泌或旁分泌一些对早期胚胎有利的物质，研究最多的是生长因子；第二，共培养体系可代谢降解或除去培养液中胚胎发育过程中产生的胚胎毒性因子，如铵、次黄嘌呤和氧自由基等等；第三，共培养细胞可能通过体细胞与胚胎的直接接触促进胚胎发育。,输卵管上皮细胞共培养技术,卵母细胞由卵巢排出后在输卵管壶腹部受精形成受精卵，输卵管可以分泌活性因子刺激胚胎发育，因此使用输卵管上皮细胞特别是输卵管壶腹部上皮与早期胚胎进行共培养，可以模拟体内的自然环境， 有利于早期胚胎的生长发育，使更多的胚胎发育至囊胚阶段。人输卵管上皮细胞是最早应用于临床的共培养细胞，1989 年 Bongso 等报道，利用人输卵管上皮与人胚胎共培养提高囊胚形成率。 Khatir 等的研究显示，输卵管上皮细胞共培养比颗粒细胞共培养更适合体外胚胎发育。,子宫内膜细胞共培养技术,胚胎在输卵管发育很短时间后进入子宫，子宫是胚胎发育的最终场所，因此亦有许多胚胎共培养体系以子宫内膜细胞为辅助细胞。 子宫内膜可以分泌许多活性因子，如白血病抑制因子（LIF）、表皮生长因子（EGF）及许多细胞因子和黏附分子，这些物质均能有效提高胚胎的发育率和质量。研究显示，利用人自体子宫内膜细胞 （含基质细胞和上皮细胞） 做饲养层与人 IVF 胚胎共培养与其在传统培养液中培养相比，胚胎细胞数显著增加，胞质碎片率明显下降，培养至囊胚阶段胚胎数增加，种植率和妊娠率提高。动物试验还显示，子宫内膜细胞共培养可增加囊胚内细胞团的细胞数， 减少细胞凋亡，从细胞生物学水平证明共培养可以提高胚胎发育潜力。最近有研究显示，子宫内膜细胞共培养比序贯培养能提高囊胚形成率、胚胎种植率和临床妊娠率。 说明共培养体系可以在体外为胚胎发育提供一种更类似于体内的环境。,卵丘细胞共培养技术,卵母细胞调节颗粒细胞的新陈代谢，而其所需的营养物质依赖卵丘细胞提供，两者间还通过缝隙连接进行信号传导，进而调节卵母细胞的生长和成熟。应用自体卵丘细胞与 IVF 得到的早期胚胎共培养，可改善胚胎质量，提高妊娠率。颗粒细胞：卵泡(follicle)中卵母细胞四周有一层菱形或扁平细胞围绕，在卵泡开始发育、卵细胞成长的同时，周围的菱形细胞变为立方形，并由单层增生成复层:颗粒细胞进入宫腔后继续分泌生长因子辅助胚胎着床。颗粒细胞生长发育形成树枝状结构固定胚胎，增加胚胎在宫腔内的黏着性。,Parikh 等首次应用颗粒细胞共培养-共移植技术，将一定数量的共培养的颗粒细胞和胚胎一起移植入子宫，提高了种植率、妊娠率和多胎率。Ebner 等改变了在行胞浆内单精子注射（ICSI）前去除卵子周围全部颗粒细胞的传统方法，而在 ICSI 时保留部分颗粒细胞共培养，改善胚胎质量，提高囊胚形成率，该项研究从另一种角度证实颗粒细胞在胚胎发育过程中的不可或缺的重要作用。颗粒细胞共培养体系促进胚胎体外发育的作用已得到肯定，但卵丘细胞共培养的效果受诸多因素的影响，如卵丘细胞密度、成熟度等。,序贯培养,序贯培养是按照体外培养胚胎在不同发育时期代谢需求不同,配制成阶段系列培养液,进行序列更换,从而延长胚胎在体外的培养时间。培养流程:d 0日使用HTF液+10%人血清(HS)进行培养,d 1日观察受精情况,更换P1液+10% HS,若受精卵数3个则更换Blasto-cyst液(B液) +10%HS,培养至d 5日(授精后9096 h)选取扩张囊胚(囊胚腔1/2胚胎体积)移植。所用培养液均于使用前1 d配制,放入37、5%二氧化碳条件下平衡过夜。优质胚胎判断标准:卵裂球规整,胞质均匀细腻,无核碎片10%。,胚胎从受精卵至2-4细胞阶段,以消耗丙酮酸为主,在无糖及磷酸盐条件下发育得更好;卵裂球挤紧以后,其代谢模式由三羧酸循环转变为糖酵解,需要培养液中糖的存在。HTF液是按照输卵管液成分配制的简单培养液,含葡萄糖、磷酸盐、丙酮酸钠与乳酸钠;P1液为不含糖与磷酸根离子、含丙酮酸钠与乳酸钠的简单培养液;B液为含糖、多种氨基酸与维生素的复杂培养液。由于序贯培养换液次数多,受外界环境影响大,污染机会相对较多,故必需有严格的实验室质控程序与无菌操作做基础,尽可能减少对胚胎的影响。,贯序联合子宫内膜细胞共培养,囊胚培养液与子宫内膜间质细胞联合培养。联合培养前 将子宫内膜细胞接种于 培养板中培养，当细胞达到 80% 90% 融合后，将子宫内膜细胞培养液换成已配制好且经过平衡过夜 的 囊 胚 培 养 液。再将D3 胚胎置于融合后的内膜细胞上，培养液每 48h 更换。,废弃胚胎体外培养仍能发育至囊胚阶段; 序贯联合子宫内膜细胞共培养的方法，与单纯的体外序贯培养相比，其囊胚形成率更高，是进行废胚继续体外培养的更有效方法.分析原因可能在于:子宫内膜细胞可分泌一些生长因子和蛋白等，如白细胞介素 ( IL - 1、6等)、胰岛素生长因子(IGF)等，对早期胚胎生长发育有利。共培养系统可以代谢降解胚胎发育过程中产生的有毒物质，如螯合重金属离子、铵、次黄嘌呤和氧自由基等，使胚胎得以更好发育。将胚胎与子宫内膜共培养，更接近体内胚胎自然生长环境，使胚胎能够更好的接受各种旁分泌和自分泌信号的调节。序贯培养为不同发育时期的胚胎提供适合其代谢需求的培养液，结合子宫内膜细胞为胚胎发育提供的促生长因子及生理环境，并减少胚胎发育中的不利因素，二者联合应用，为胚胎体外发育提供更多有利条件。,子宫内膜细胞共培养联合序贯成组培养对人早期冷冻时限较长的胚胎发育具有积极的支持作用，可为充分利用宝贵资源进行胚胎实验室质控、胚胎干细胞研究等领域提供支持性方案。,囊胚培养的缺点,囊胚培养要求条件高，由于实验室培养条件或胚胎自身原因，胚胎可能会停止发育或退化，导致没有胚胎可移植。不能浪费较多的卵裂期胚胎：由于体外培养环境终究不是体内自然环境，延长培养时间