分子发光—荧光、磷光和化学

分子发光 荧光 磷光和化学发光molecularluminescenceanalysis 概论分子荧光和磷光光谱分析法化学发光分析法 教学要求 掌握荧光的产生 荧光效率及其影响因素 重点掌握溶液强度与溶液浓度的关系及定量分析方法 弄清荧光分析仪器的主要部件及与分子吸收仪器的主要区别 了解磷光分析法及化学发光分析法 重点 荧光效率及影响因素 溶液强度与溶液浓度的关系及定量分析方法 难点 荧光的产生 影响荧光效率的因素 概述 一 分子发光的类型荧光Fluorescence磷光Phosphorescence化学发光Chemiluminescence 光致发光 特点 灵敏度高 1 100ppb 有的可达0 01ppb 比吸收光度法高2 3个数量级 WHY 选择性好方法简单快速 用样量少应用不太广泛 分子荧光与磷光光谱分析法molecularfluorescenceandphosphorescence 荧光 16世纪 在矿物和植物提取液中发现荧光 1575年 Monardes 植物愈创木切片黄色水溶液 天兰色荧光 1852年 Stokes阐明荧光发射机制 分光计观测奎宁和叶绿素的荧光 发现波长稍长于入射光的波长 认识到荧光为 重新发光 而不是漫射光 1905年 Wood发现气体分子的共振荧光 1926年 Gaviola直接测定了荧光寿命 1923年 荧光X射线光谱 1964年 原子荧光光谱分析的建立 1965年 荧光分析在生物分析中广泛应用 磷光 15世纪被发现 重晶石在强烈阳光下的发光 1944年 Lewis提出磷光用于分析的可能性 1957年 Keirs将磷光分析用于定量分析及多组份混合物分析 1963年 广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析 一 荧光和磷光的产生luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence1 分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂 在每个电子能级上 都存在振动 转动能级 基态 S0 激发态 S1 S2 激发态振动能级 吸收特定频率的辐射 量子化 跃迁一次到位 激发态 基态 多种途径和方式 速度最快 激发态寿命最短的途径占优势 2 电子激发态的多重度 电子激发态的多重度 M 2S 1平行自旋比成对自旋稳定 洪特规则 三重态 tripletstate 能级比相应单重态 singletstate 能级低 激发单重态 分子吸收能量 电子自旋仍然配对 为单重态 称为激发单重态 以S1 S2 表示 激发三重态 分子吸收能量 电子自旋不再配对 为三重态 称为激发三重态 以T1 T2 表示 大多数有机分子的基态处于单重态 电子自旋配对 多重度 2s 1 1 为单重态 以S0表示 S0 T1禁阻跃迁 单重态基态S0 单重态基态S0 泡利不相容原理 三重态tripletstate 激发后S T两态 激发态 单重态与三重态 Mg的基态与第一激发态 基态 1st激发态 3s 3p 内量子数J有2S 1个取值 L S L S 1 L S L 0 用S表示 1 用P表示 1J 012 1 0 光谱项 改变自旋 禁阻 磷光 3p 3 激发态 基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态 返回基态时 通过辐射跃迁 发光 和无辐射跃迁等方式失去能量 去活化 激发态停留时间短 返回速度快的途径 发生的几率大 发光强度相对大 荧光 10 7 10 9s 第一激发单重态的最低振动能级 基态 磷光 10 4 10s 第一激发三重态的最低振动能级 基态 能量传递过程 1 振动弛豫 VibrationalRelaxation VR 在液相或压力足够高的气相中 处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子 从而从高振动能层失活至低振动能层的过程 称为振动弛豫 2 内转换 InternalConversion IC 对于具有相同多重度的分子 若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时 则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁 如S2 S1 T2 T1 3 外转换 ExternalConversion EC 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程 也称 熄灭 或 猝灭 4 系间跨跃 IntersystemConversion ISC 系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁 如从S1到T1 该跃迁是禁阻的 然而 当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化 即可通过自旋 轨道耦合而产生无辐射跃迁 该过程称为系间跨跃 5 荧光发射分子电子从单重激发态 Kasha规则 的最低振动能级在很短时间 10 9 10 6s 跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光 由于各种去活化过程的存在 荧光辐射能通常要比激发能量低 或者说 荧光波长大于激发波长 Stokes效应 7 磷光发射从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后 再经振动弛豫回到三重态最低振动能层 最后 在10 4 10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射 在光照停止后 磷光仍可持续一段时间 8 延迟荧光通常 发生系间窜跃时 电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处 有时 通过热激发 有可能发生T1 S1 然后由S1发生荧光 这是产生延迟荧光的机理 去活化演示 e e 吸收 驰豫 e e S0 S0 S2 S1 去活化演示 e 内部转换 e 荧光 e 荧光的产生过程 荧光的产生 e e e e 二 荧光 磷光与化学结构的关系 1 荧光量子产率荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率 它表示物质发射荧光的能力 通常用下式表示或在产生荧光的过程中 涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程 如荧光发射 内转移 系间跨跃和外转移等 很明显 荧光的量子产率 将与上述每一个过程的速率常数有关 kf 应光发射过程的速率常数 可见 凡是使kf增加 使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率 通常 kf由分子结构决定 内因 而其它参数则由化学环境和结构共同决定 分析应用价值 量子产率 0 1 2 荧光 磷光与有机化合物结构的关系 1 跃迁类型 通常 具有 及n 跃迁结构的分子才会产生荧光 而且 跃迁的量子效率比n 跃迁的要大得多 前者 大 寿命短 kISC小 2 荧光 磷光和有机化合物分子结构的关系 1 跃迁类型 通常 具有 及n 跃迁结构的分子才会产生荧光 而且 跃迁的量子效率比n 跃迁的要大得多 前者 大 寿命短 kISC小 跃迁自旋许可跃迁 有利于荧光发射n 跃迁自旋禁阻跃迁 有利于磷光发射 2 共轭体系 共轭度越大 分子的荧光效率越大 且荧光光谱向长波方向移动 增大共轭萘 f 0 29 f 310nm蒽 f 0 46 f 400nm在多烯结构中 ph CH CH 3ph和ph CH CH 2ph在苯中的荧光效率分别为0 68和0 28 绝大多数能发荧光的物质为含芳香环或杂环的化合物 3 平面刚性结构 分子刚性 Rigidity 越强 分子振动少 与其它分子碰撞失活的机率下降 荧光量子效率提高 4 取代基 给电子取代基增强荧光 p 共轭 荧光波长红移 如 OH OR NH2 CN NR2等 吸电子基降低荧光 而使磷光加强 如 COOH C O NO2 NO X等 重原子降低荧光但增强磷光 如苯环被卤素取代 从氟苯到碘苯 荧光逐渐减弱到消失 该现象也称重原子效应 有利因素增大共轭刚性结构给电子基团不含杂原子 3 无机化合物的荧光 1 螯合物中配位体的发光不少有机化合物虽然具有共轭双键 但由于不是刚性结构 分子处于非同一平面 因而不发生荧光 若这些化合物和金属离子形成螯合物 随着分子的刚性增强 平面结构的增大 常会发生荧光 如8 羟基喹啉本身有很弱的荧光 但其金属螯合物具有很强的荧光 2 螯合物中金属离子的特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的 跃迁激发 接着配位体把能量转给金属离子 导致d d 跃迁和f f 跃迁 最终发射的是d d跃迁和f f跃迁光谱 三 影响光致发光的因素1 荧光强度与溶液浓度的关系 泰勒级数展开 常A 0 05 If与A的关系A与c正比 低浓度 1 溶剂对荧光强度的影响 溶剂极性可增加或降低荧光强度 改变 及n 跃迁的能量 并使荧光峰发生移动 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度 并使荧光峰发生移动 2 温度 温度上升使荧光强度下降 其中一个原因是分子的内部能量转化作用 当激发分子接受额外热能时 有可能使激发能转换为基态的振动能量 随后迅速振动弛豫而丧失振动能量 另一个原因是碰撞频率增加 使外转换的去活几率增加 因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度 2 影响荧光强度的因素 3 pH值的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关 不同的pH值 化合物所处状态不同 不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同 因此 它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别 对于金属离子与有机试剂形成的发光螯合物 一方面pH会影响螯合物的形成 另一方面还会影响螯合物的组成 因而影响它们的荧光性质 4 荧光的熄灭 猝灭 效应荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光熄灭 能引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂 猝灭剂 碰撞猝灭及能量转移 主要 外部转换热效应溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降 氧熄灭 顺磁性氧分子 促系间跨跃成三重态 尤其对无取代基的芳香族化合物的荧光影响较为显著 溶剂粘度大 温度高 自熄灭 自吸收自熄 浓度高时 激发态之间相互碰撞自吸 荧光曲线与吸收曲线重叠时 被基态分子吸收 低浓度 四 荧光和磷光的分析仪器 一 荧光光度计 与分光光度计的主要差别 垂直测量方式 消除透射光影响 两个单色器 激发和发射 常用光栅 光源 常用氙灯 高压汞灯和激光光源 要求 强度大 使用波长范围宽 试样室 四面光石英池固体试样架 四面光比色皿 二 激发光谱和荧光 磷光光谱excitationspectrumandfluorescence phosphorescence spectrum1 荧光 磷光 的激发光谱曲线 Ex固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光 磷光 强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 色散系统 光栅第一单色器选激发光波长第二单色器选荧光波长 检测器 光电倍增管 2 荧光光谱 或磷光光谱 Em 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光 或磷光强度 与发射光波长关系曲线 图中曲线II或III 由于存在各种形式的无辐射跃迁 损失了部分能量 故最大发射波长都向长波方向移动 尤以磷光波长的移动最多 且它的强度也相对较弱 注意 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态 而具有几个吸收带 由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的速率较高 远大于由高能激发态直接发射光子的速率 故在荧光发射时 不论用哪一个波长的光辐射激发 电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层 所以荧光发射光谱与激发波长无关 三 磷光计 与荧光仪一体化 试样室 试样池放在液氮杜瓦瓶内固体表面磷光需特制试样室 磷光镜 一种机械切光装置 转筒式和转盘式时间分辨技术 去荧光 磷光仪中的2种机械切光器 五 荧光 磷光分析方法与应用 1 特点 1 灵敏度高比紫外 可见分光光度法高2 4个数量级 为什么 检测下限 0 1 0 1 g cm 3相对灵敏度 0 05mol L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液 2 选择性强既可依据特征发射光谱 又可根据特征吸收光谱 3 试样量少缺点 应用范围小 一 荧光分析法的应用 1 无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量 可测量约60多种元素 铍 铝 硼 镓 硒 镁 稀土常采用荧光分析法 氟 硫 铁 银 钴 镍采用荧光熄灭法测定 铜 铍 铁 钴 锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬 铌 铀 碲采用低温荧光法测定 铈 铕 锑 钒 铀采用固体荧光法测定 2 有机化合物的分析脂肪族分子结构较为简单 本身会产生荧光的很少 只有与其它有机试剂作用后可产生荧光 芳香族化合物具有不饱和的共轭体系 多能发生荧光 此外如胺类 甾族化合物 蛋白质 酶与辅酶 维生素等均可用荧光法进行分析 三 磷光分析法的应用在分析对象上 与荧光法互补 1 稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物 致癌物质 2 农药 生物碱 植物生长激素的分析烟碱 降烟碱 新烟碱 2 4 D等分析检测限0 01 g cm 33 药物分析和临床分析 一 概述 化学反应产生激发态分子 光发射 用于痕量元素 环境检测 生物医学分析 与荧光法互补 9 2化学发光Chemiluminescence 特点 灵敏度高 鲁米诺体系测定Cr3 等检测限10 9g L 线性范围宽 5 6个数量级 发射光强度测量无干扰 无背景光 散射光干扰 设备简单 无光源 无需单色器 测发光总量 快速 缺点 可供发光用的试剂少 发光反应效率低 大大低于生物体中的发光 机理研究少 二 化学发光分析的基本原理principle 一 化学发光反应的条件 能快速释放出足够的能量 化学反应必须提供足够的激发能 激发能主要来源于反应焓 要有有利的化学反应历程 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态 激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子 而使该分子激发 然后以辐射光子的形式回到基态 二 化学发光反应 基于化学反应所提供的足够的能量 使其中一种反应产物的分子的电子被激发 形成激发态分子 当它们从激发态跃回基态时 发出一定波长的光 A B C D D D h 1 能够发光的化合物大多为有机化合物 芳香族化合物 2 化学发光反应多为氧化还原反应 激发能与反应能相当 E 170 300kJ mol 位于可见光区 3 发光持续时间较长 反应持续进行 化学发光反应存在于生物体 萤火虫 海洋发光生物 中 称生物发光 bioluminescence 三 化学发光效率 化学效率 发光效率 时刻t的化学发光强度 单位时间发射的光量子数 dc dt分析物参加反应的速率 四 化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中 被分析物浓度相对于发光试剂小得多 对于一级动力学反应 dc dt Kc K为反应速率常数 定量依据 1 在一定条件下 峰值光强度与被测物浓度成线性 2 在一定条件下 曲线下面积为发光总强度 S 其与被测物浓度成线性 三 化学发光反应的类型 一 气相化学发光反应1 臭氧的化学发光反应没食子酸 O3 A O2罗丹明B A 罗丹明B B罗丹明B 罗丹明B h 2 氮氧化合物的化学发光反应NO O3 NO2 NO2 NO2 h 发射的光谱范围 600 875nm 灵敏度1ng cm 3 可间接测定NO2 还原为NO 和NH3 高温氧化为NO2 测量汽车尾气中NOx 3 氧原子与SO2 NO CO的发光反应 O3 O2 O 1000 C石英管中进行 SO2 O O SO2 O2SO2 SO2 h 最大发射波长 200nm 灵敏度1ng cm 34 火焰化学发光在富氢火焰中 也存在着很强的化学发光反应 1 一氧化氮NO H HNO HNO HNO h 发射光谱范围 660 770nm 最大发射波长 690nm 在富氢火焰中 NO2 2H NO H2O可用此法测定空气中的NOx的总量 还可与气相色谱联用 作为氮化合物的检测器 2 挥发性硫化物 挥发性硫化物SO2 H2S CH3SH CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧 产生很强的化学发光 蓝色 SO2 2H2 S 2H2OS S 2S2 S2 S2 h 发射光谱范围 350 460nm 最大发射