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考马斯亮蓝G 250法测定蛋白质含量 实验目的 了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤 实验原理 考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态呈红褐色 与蛋白质结合后呈蓝色 其最大吸收波长由465nm转变为595nm 在一定的蛋白质浓度范围内 595nm处的光密度值与蛋白质浓度成反比 可用比色法进行蛋白质定量测定 仪器和试剂 1 仪器 分析天平 吸管0 1ml 1 1ml 2 5ml 1 试管10个 722型分光光度计 容量瓶100ml 1000ml各一个 2 试剂 1 0 9 NaCl溶液 2 标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白 溶于蒸馏水并定容至100ml 制成0 1mg ml的原液 3 考马斯亮蓝G 250 0 01 染液 称取0 1g考马斯亮蓝G 250 溶于50ml90 乙醇中 加入85 m v 的磷酸100ml 最后用蒸馏水定容至1000ml 此溶液不宜久存 在常温中可放置1 2个月 4 样品液 取牛血清白蛋白0 1mg ml的溶液 用0 9 NaCl溶液稀释至一定浓度 操作步骤 1 0 100 g mL标准曲线的制作 取6支试管 编号后 按下表加入试剂 混匀 室温静置5min后 以管1为空白对照 在595nm下比色测定 以标准蛋白质含量 g 为横坐标 吸光度为纵坐标 绘出标准曲线 2 样品中蛋白质含量的测定另取两支干净的试管 做一重复 加入合适浓度的待测样品 使其测定值在标准曲线的范围内 测定方法同上 由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量 计算 样品的蛋白质含量 g g鲜重 查得的蛋白质含量 g 样品鲜重 g 注意事项 1 如果要求严格 最好在试剂加入后的5 20min内测定光吸收 因为这段时间内颜色是最稳定的 2 测定中 蛋白 染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上 不可使用石英比色皿 因不易洗去染色 可用塑料或玻璃比色皿 使用后立即用少量95 的乙醇荡洗 以洗去染色 塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡 思考题 1 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法 并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点 2 根据下列所给的条件和要求 选择一种或几种常用的方法测定蛋白质的浓度 1 样品不易溶解 但要求结果较
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